कृमिनाशक दवा एन,एन-डाइएथिल-एम-टोलुआमाइड (डीईईटीडीईईटी (DEET) एसीटाइलकोलिनेस्टेरेज (AChE) को बाधित करता है और अत्यधिक रक्त वाहिका निर्माण के कारण इसमें कैंसरजनक गुण होने की संभावना है। इस शोध पत्र में, हम दर्शाते हैं कि डीईईटी विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्तेजित करता है जो एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देती हैं, जिससे ट्यूमर की वृद्धि बढ़ती है। डीईईटी एंजियोजेनेसिस की ओर ले जाने वाली कोशिकीय प्रक्रियाओं को सक्रिय करता है, जिसमें प्रसार, प्रवासन और आसंजन शामिल हैं। यह एंडोथेलियल कोशिकाओं में NO उत्पादन और VEGF अभिव्यक्ति में वृद्धि से जुड़ा है। M3 को निष्क्रिय करने या औषधीय M3 अवरोधकों का उपयोग करने से ये सभी प्रभाव समाप्त हो गए, जिससे पता चलता है कि डीईईटी-प्रेरित एंजियोजेनेसिस M3-संवेदनशील है। M3 रिसेप्टर्स को अधिक मात्रा में व्यक्त करने वाली एंडोथेलियल और HEK कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग से जुड़े प्रयोगों के साथ-साथ बंधन और डॉकिंग अध्ययनों से संकेत मिलता है कि डीईईटी M3 रिसेप्टर्स के एक एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, डीईईटी एसीएचई को बाधित करता है, जिससे एसिटाइलकोलीन की जैव उपलब्धता और M3 रिसेप्टर्स से इसका बंधन बढ़ जाता है, और एलोस्टेरिक विनियमन के माध्यम से प्रोएंजियोजेनिक प्रभावों को बढ़ाता है।
प्राथमिक ईसी को स्विस चूहों की महाधमनी से पृथक किया गया था। निष्कर्षण विधि को कोबायाशी प्रोटोकॉल 26 से अनुकूलित किया गया था। मूरिन ईसी को चौथे पैसेज तक 5% ऊष्मा-निष्क्रिय एफबीएस के साथ पूरक ईबीएम-2 माध्यम में संवर्धित किया गया था।
HUVEC, U87MG, या BF16F10 कोशिकाओं के प्रसार पर DEET की दो सांद्रताओं के प्रभाव का विश्लेषण CyQUANT सेल प्रोलिफरेशन एसे किट (मॉलिक्यूलर प्रोब्स, C7026) का उपयोग करके किया गया। संक्षेप में, 96-वेल प्लेट में प्रति वेल 5.103 कोशिकाएं डाली गईं, उन्हें रात भर जुड़ने दिया गया, और फिर 24 घंटे के लिए DEET से उपचारित किया गया। वृद्धि माध्यम को हटाने के बाद, माइक्रोप्लेट के प्रत्येक वेल में डाई बाइंडिंग सॉल्यूशन डालें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 485 एनएम उत्तेजना फिल्टर और 530 एनएम उत्सर्जन फिल्टर से सुसज्जित मिथ्रास LB940 मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (बर्थोल्ड टेक्नोलॉजीज, बैड वाइल्डबैड, जर्मनी) का उपयोग करके फ्लोरेसेंस स्तरों का निर्धारण किया गया।
HUVEC कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में 104 कोशिका प्रति वेल की घनत्व पर बोया गया। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए DEET से उपचारित किया गया। कोशिका व्यवहार्यता का आकलन कलरिमेट्रिक MTT परख (सिग्मा-एल्ड्रिच, M5655) का उपयोग करके किया गया। ऑप्टिकल घनत्व मान 570 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (मिथ्रास LB940) पर प्राप्त किए गए।
इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परीक्षणों का उपयोग करके DEET के प्रभावों का अध्ययन किया गया। 10⁻⁸ M या 10⁻⁵ M DEET के साथ उपचार से HUVECs में केशिकाओं की लंबाई में वृद्धि हुई (चित्र 1a, b, सफेद बार)। नियंत्रण समूह की तुलना में, 10⁻¹⁴ से 10⁻⁵ M तक की DEET सांद्रता के साथ उपचार से पता चला कि 10⁻⁸ M DEET पर केशिकाओं की लंबाई एक पठार पर पहुंच गई (पूरक चित्र S2)। 10⁻⁸ M और 10⁻⁵ M सांद्रता सीमा में DEET के साथ उपचारित HUVECs के इन विट्रो प्रोएंजियोजेनिक प्रभाव में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
नव संवहनीकरण पर DEET के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने इन विवो नव संवहनीकरण अध्ययन किए। 14 दिनों के बाद, 10⁻⁸ M या 10⁻⁵ M DEET के साथ पूर्व-संवर्धित एंडोथेलियल कोशिकाओं से इंजेक्ट किए गए चूहों में हीमोग्लोबिन की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 1c, सफेद बार)।
इसके अतिरिक्त, DEET-प्रेरित नवसंवहनीकरण का अध्ययन U87MG ज़ेनोग्राफ़्ट-युक्त चूहों में किया गया, जिन्हें प्रतिदिन (आईपी) DEET का इंजेक्शन दिया गया था। यह इंजेक्शन 10⁻⁵ M की प्लाज्मा सांद्रता उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है, जो मनुष्यों में सामान्य है। 23. चूहों में U87MG कोशिकाओं के इंजेक्शन के 14 दिन बाद पता लगाने योग्य ट्यूमर (अर्थात 100 mm³ से बड़े ट्यूमर) देखे गए। 28वें दिन, DEET-उपचारित चूहों में ट्यूमर की वृद्धि नियंत्रण चूहों की तुलना में काफी अधिक थी (चित्र 1d, वर्ग)। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर के CD31 विरंजन से पता चला कि DEET ने केशिका क्षेत्र को काफी हद तक बढ़ाया, लेकिन सूक्ष्म वाहिका घनत्व को नहीं (चित्र 1e-g)।
DETA-प्रेरित प्रसार में मस्कैरिनिक रिसेप्टर्स की भूमिका निर्धारित करने के लिए, pFHHSiD (10-7 M, एक चयनात्मक M3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी) की उपस्थिति में 10-8 M या 10-5 M DETA का उपयोग किया गया। HUVEC पर pFHHSiD के उपचार से DETA के प्रसार गुणों को सभी सांद्रताओं पर पूर्णतः अवरुद्ध कर दिया गया (तालिका 1)।
इन परिस्थितियों में, हमने यह भी जांचा कि क्या DEET, HUVEC कोशिकाओं में केशिकाओं की लंबाई बढ़ाएगा। इसी प्रकार, pFHHSiD ने DEET-प्रेरित केशिका लंबाई में वृद्धि को काफी हद तक रोका (चित्र 1a, b, धूसर पट्टियाँ)। इसके अलावा, M3 siRNA के साथ भी इसी प्रकार के प्रयोग किए गए। यद्यपि नियंत्रण siRNA केशिका निर्माण को बढ़ावा देने में प्रभावी नहीं था, M3 मस्कैरिनिक रिसेप्टर को निष्क्रिय करने से DEET द्वारा केशिका लंबाई बढ़ाने की क्षमता समाप्त हो गई (चित्र 1a, b, काली पट्टियाँ)।
इसके अलावा, इन विट्रो में 10-8 M या 10-5 M DEET-प्रेरित संवहनीकरण और इन विवो में नव संवहनीकरण दोनों को pFHHSiD द्वारा पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया गया था (चित्र 1c, d, वृत्त)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि DEET चयनात्मक M3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी या M3 siRNA के प्रति संवेदनशील मार्ग के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देता है।
AChE, DEET का आणविक लक्ष्य है। डोनेपेज़िल जैसी दवाएँ, जो AChE अवरोधक के रूप में कार्य करती हैं, इन विट्रो और माउस हिंडलम्ब इस्केमिया मॉडल में एंडोथेलियल एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित कर सकती हैं।14 हमने HUVEC में AChE एंजाइम गतिविधि पर DEET की दो सांद्रताओं के प्रभाव का परीक्षण किया। नियंत्रण स्थितियों की तुलना में DEET की कम (10-8 M) और उच्च (10-5 M) सांद्रताओं ने एंडोथेलियल AChE गतिविधि को कम कर दिया (चित्र 2)।
DEET की दोनों सांद्रताओं (10⁻⁸ M और 10⁻⁵ M) ने HUVEC पर एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज गतिविधि को कम कर दिया। BW284c51 (10⁻⁵ M) का उपयोग एसिटाइलकोलिनेस्टेरेज अवरोधकों के नियंत्रण के रूप में किया गया था। परिणामों को वाहन-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में DEET की दो सांद्रताओं से उपचारित HUVEC पर AChE गतिविधि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया है। मान छह स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किए गए हैं। *p < 0.05 नियंत्रण की तुलना में (क्रुस्कल-वालिस और डन बहु-तुलना परीक्षण)।
नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) एंजियोजेनिक प्रक्रिया में शामिल होता है³³, इसलिए DEET-उत्तेजित HUVECs में NO उत्पादन का अध्ययन किया गया। DEET-उपचारित एंडोथेलियल NO उत्पादन नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में बढ़ा हुआ था, लेकिन यह केवल 10⁻⁸ M की खुराक पर ही महत्वपूर्ण स्तर तक पहुंचा (चित्र 3c)। DEET-प्रेरित NO उत्पादन को नियंत्रित करने वाले आणविक परिवर्तनों का निर्धारण करने के लिए, वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा eNOS अभिव्यक्ति और सक्रियण का विश्लेषण किया गया। यद्यपि DEET उपचार ने eNOS अभिव्यक्ति को नहीं बदला, इसने eNOS फॉस्फोराइलेशन में अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में इसके सक्रियण स्थल (Ser-1177) पर eNOS फॉस्फोराइलेशन को काफी हद तक बढ़ा दिया, जबकि इसके अवरोधक स्थल (Thr-495) पर इसे कम कर दिया (चित्र 3d)। इसके अलावा, सक्रियण स्थल और अवरोधक स्थल पर फॉस्फोराइलेटेड eNOS के अनुपात की गणना फॉस्फोराइलेटेड eNOS की कुल मात्रा के सापेक्ष सामान्यीकृत करने के बाद की गई। डीईईटी की प्रत्येक सांद्रता से उपचारित एचयूवीईसी में यह अनुपात अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में काफी बढ़ गया था (चित्र 3डी)।
अंत में, प्रमुख प्रोएंजियोजेनिक कारकों में से एक, वीईजीएफ की अभिव्यक्ति का विश्लेषण वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा किया गया। डीईईटी ने वीईजीएफ अभिव्यक्ति को काफी हद तक बढ़ा दिया, जबकि पीएफएचएचएसआईडी ने इस अभिव्यक्ति को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया।
चूंकि डीईईटी के प्रभाव फार्माकोलॉजिकल ब्लॉकेज और एम3 रिसेप्टर्स के डाउनरेगुलेशन दोनों के प्रति संवेदनशील होते हैं, इसलिए हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया कि डीईईटी कैल्शियम सिग्नलिंग को बढ़ा सकता है। आश्चर्यजनक रूप से, डीईईटी दोनों सांद्रताओं पर एचयूवीईसी (डेटा प्रदर्शित नहीं किया गया) और एचईके/एम3 (चित्र 4ए, बी) में साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम को बढ़ाने में विफल रहा।
पोस्ट करने का समय: 30 दिसंबर 2024