कृमिनाशक दवा एन,एन-डाइएथिल-एम-टोलुआमाइड (डीईईटी) एंडोथेलियल कोशिकाओं में मस्कैरिनिक एम3 रिसेप्टर्स के एलोस्टेरिक मॉड्यूलेशन के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करती है।

  
कृमिनाशक दवा एन,एन-डाइएथिल-एम-टोलुआमाइड (डीईईटी) को एसीई (एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़) को बाधित करने वाला बताया गया है और अत्यधिक रक्तवाहिकाकरण के कारण इसमें संभावित कैंसरकारी गुण होते हैं। इस शोधपत्र में, हम दर्शाते हैं कि डीईईटी विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्तेजित करता है जो एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देती हैं, जिससे ट्यूमर की वृद्धि बढ़ती है। डीईईटी एंजियोजेनेसिस की ओर ले जाने वाली कोशिकीय प्रक्रियाओं को सक्रिय करता है, जिसमें प्रसार, प्रवास और आसंजन शामिल हैं। यह एंडोथेलियल कोशिकाओं में बढ़े हुए एनओ उत्पादन और वीईजीएफ अभिव्यक्ति से जुड़ा है। एम3 को शांत करने या औषधीय एम3 अवरोधकों के उपयोग से ये सभी प्रभाव समाप्त हो गए, जिससे पता चलता है कि डीईईटी-प्रेरित एंजियोजेनेसिस एम3-संवेदनशील है। एम3 रिसेप्टर्स की अति-अभिव्यक्ति वाली एंडोथेलियल और एचईके कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग से जुड़े प्रयोगों, साथ ही बंधन और डॉकिंग अध्ययनों से संकेत मिलता है कि डीईईटी एम3 रिसेप्टर्स के एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, डीईईटी एसीई को बाधित करता है, जिससे एसिटाइलकोलाइन की जैवउपलब्धता और एम3 रिसेप्टर्स से इसका बंधन बढ़ता है, और एलोस्टेरिक विनियमन के माध्यम से प्रोएंजियोजेनिक प्रभावों में वृद्धि होती है।
प्राथमिक ईसी को स्विस चूहों की महाधमनी से अलग किया गया। निष्कर्षण विधि कोबायाशी प्रोटोकॉल 26 से अनुकूलित की गई थी। मूषक ईसी को चौथे मार्ग तक 5% ऊष्मा-निष्क्रिय एफबीएस युक्त ईबीएम-2 माध्यम में संवर्धित किया गया।
HUVEC, U87MG, या BF16F10 के प्रसार पर DEET की दो सांद्रताओं के प्रभाव का विश्लेषण CyQUANT कोशिका प्रसार परख किट (आणविक जांच, C7026) का उपयोग करके किया गया। संक्षेप में, प्रति वेल 5.103 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट में बोया गया, रात भर जुड़े रहने दिया गया, और फिर 24 घंटे के लिए DEET से उपचारित किया गया। वृद्धि माध्यम को हटाने के बाद, माइक्रोप्लेट के प्रत्येक वेल में डाई बाइंडिंग घोल डालें और कोशिकाओं को 37°C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रतिदीप्ति स्तरों का निर्धारण 485 nm उत्तेजन फिल्टर और 530 nm उत्सर्जन फिल्टर से सुसज्जित मिथ्रास LB940 मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (बर्थोल्ड टेक्नोलॉजीज, बैड वाइल्डबैड, जर्मनी) का उपयोग करके किया गया।
HUVEC को 96-वेल प्लेटों में 104 कोशिकाओं प्रति वेल के घनत्व पर बोया गया। कोशिकाओं को 24 घंटे तक DEET से उपचारित किया गया। कोशिका व्यवहार्यता का आकलन एक वर्णमिति MTT परख (सिग्मा-एल्ड्रिच, M5655) का उपयोग करके किया गया। ऑप्टिकल घनत्व मान 570 nm तरंगदैर्ध्य पर एक मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (मिथ्रास LB940) पर प्राप्त किए गए।
डीईईटी के प्रभावों का अध्ययन इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परीक्षणों का उपयोग करके किया गया। 10-8 एम या 10-5 एम डीईईटी से उपचार करने पर एचयूवीईसी में केशिका लंबाई का निर्माण बढ़ा (चित्र 1ए, बी, सफेद पट्टियाँ)। नियंत्रण समूह की तुलना में, 10-14 से 10-5 एम तक की डीईईटी सांद्रता के साथ उपचार से पता चला कि केशिका लंबाई 10-8 एम डीईईटी पर स्थिर हो गई (पूरक चित्र एस2)। 10-8 एम और 10-5 एम की सांद्रता सीमा में डीईईटी से उपचारित एचयूवीईसी के इन विट्रो प्रोएंजियोजेनिक प्रभाव में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
नवसंवहनीकरण पर डीईईटी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने इन विवो नवसंवहनीकरण अध्ययन किए। 14 दिनों के बाद, 10-8 एम या 10-5 एम डीईईटी से पूर्व-संवर्धित एंडोथेलियल कोशिकाओं के इंजेक्शन वाले चूहों में हीमोग्लोबिन की मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 1सी, सफेद पट्टियाँ)।
इसके अलावा, यू87एमजी ज़ेनोग्राफ्ट-धारक चूहों में डीईईटी-प्रेरित नवसंवहनीकरण का अध्ययन किया गया, जिन्हें प्रतिदिन (आईपी) डीईईटी की एक ऐसी खुराक दी गई जो 10-5 एम के प्लाज्मा सांद्रता को प्रेरित करने के लिए जानी जाती है, जो कि उजागर मनुष्यों में सामान्य है। 23 में, चूहों में यू87एमजी कोशिकाओं के इंजेक्शन के 14 दिन बाद पता लगाने योग्य ट्यूमर (अर्थात 100 मिमी3 से अधिक के ट्यूमर) देखे गए। 28वें दिन, नियंत्रण चूहों की तुलना में डीईईटी-उपचारित चूहों में ट्यूमर की वृद्धि में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 1डी, वर्ग)। इसके अलावा, ट्यूमर के सीडी31 अभिरंजन से पता चला कि डीईईटी ने केशिका क्षेत्र में उल्लेखनीय वृद्धि की, लेकिन सूक्ष्मवाहिनी घनत्व में नहीं। (चित्र 1ई-जी)।
डीईटीए-प्रेरित प्रसार में मस्कैरिनिक रिसेप्टर्स की भूमिका निर्धारित करने के लिए, पीएफएचएचएसआईडी (10-7 एम, एक चयनात्मक एम3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी) की उपस्थिति में 10-8 एम या 10-5 एम डीईटीए का उपयोग किया गया। एचयूवीईसी के उपचार में, पीएफएचएचएसआईडी ने सभी सांद्रताओं पर डीईटीए के प्रसार गुणों को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया (सारणी 1)।
इन परिस्थितियों में, हमने यह भी जाँच की कि क्या DEET HUVEC कोशिकाओं में केशिकाओं की लंबाई बढ़ाएगा। इसी प्रकार, pFHHSiD ने DEET-प्रेरित केशिकाओं की लंबाई को महत्वपूर्ण रूप से रोका (चित्र 1a, b, धूसर पट्टियाँ)। इसके अलावा, M3 siRNA के साथ भी इसी तरह के प्रयोग किए गए। हालाँकि नियंत्रण siRNA केशिका निर्माण को बढ़ावा देने में प्रभावी नहीं था, M3 मस्कैरिनिक रिसेप्टर को शांत करने से DEET की केशिकाओं की लंबाई बढ़ाने की क्षमता समाप्त हो गई (चित्र 1a, b, काली पट्टियाँ)।
इसके अलावा, 10-8 M या 10-5 M DEET-प्रेरित इन-विट्रो संवहनीकरण और इन-विवो नव-संवहनीकरण, दोनों को pFHHSiD द्वारा पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया गया (चित्र 1c, d, वृत्त)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि DEET चयनात्मक M3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी या M3 siRNA के प्रति संवेदनशील मार्ग के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देता है।
एसीई (AChE) डीईईटी का आणविक लक्ष्य है। डोनेपेज़िल जैसी दवाएँ, जो एसीई अवरोधकों के रूप में कार्य करती हैं, इन विट्रो और चूहे के हिंदलिंब इस्केमिया मॉडल में ईसी एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित कर सकती हैं14। हमने एचयूवीईसी में एसीई एंजाइम गतिविधि पर डीईईटी की दो सांद्रताओं के प्रभाव का परीक्षण किया। नियंत्रण स्थितियों की तुलना में डीईईटी की कम (10-8 एम) और उच्च (10-5 एम) सांद्रता ने एंडोथेलियल एसीई गतिविधि को कम कर दिया (चित्र 2)।
डीईईटी (10-8 एम और 10-5 एम) की दोनों सांद्रताओं ने एचयूवीईसी पर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ गतिविधि को कम कर दिया। बीडब्ल्यू284सी51 (10-5 एम) का उपयोग एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ अवरोधकों के नियंत्रण के रूप में किया गया था। परिणाम वाहन-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में डीईईटी की दोनों सांद्रताओं से उपचारित एचयूवीईसी पर एसीई गतिविधि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए हैं। मान छह स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसईएम के रूप में व्यक्त किए गए हैं। *p < 0.05 नियंत्रण की तुलना में (क्रुस्कल-वालिस और डन बहु तुलना परीक्षण)।
नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) एंजियोजेनिक प्रक्रिया 33 में शामिल है, इसलिए, DEET-उत्तेजित HUVECs में NO उत्पादन का अध्ययन किया गया। DEET-उपचारित एंडोथेलियल NO उत्पादन नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में बढ़ा था, लेकिन केवल 10-8 M की खुराक पर ही महत्वपूर्ण हो पाया (चित्र 3c)। DEET-प्रेरित NO उत्पादन को नियंत्रित करने वाले आणविक परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए, वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा eNOS अभिव्यक्ति और सक्रियण का विश्लेषण किया गया। यद्यपि DEET उपचार ने eNOS अभिव्यक्ति को नहीं बदला, लेकिन इसने eNOS फॉस्फोराइलेशन में अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में इसके सक्रियण स्थल (Ser-1177) पर eNOS फॉस्फोराइलेशन को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा दिया, जबकि इसके निरोधात्मक स्थल (Thr-495) को कम कर दिया (चित्र 3d)। डीईईटी की प्रत्येक सांद्रता के साथ उपचारित एचयूवीईसी में यह अनुपात अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में काफी बढ़ गया था (चित्र 3डी)।
अंत में, वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा मुख्य प्रोएंजियोजेनिक कारकों में से एक, वीईजीएफ की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। डीईईटी ने वीईजीएफ अभिव्यक्ति को उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया, जबकि पीएफएचएचएसआईडी ने इस अभिव्यक्ति को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया।
चूँकि डीईईटी के प्रभाव औषधीय अवरोध और एम3 रिसेप्टर्स के डाउनरेगुलेशन, दोनों के प्रति संवेदनशील होते हैं, इसलिए हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया कि डीईईटी कैल्शियम सिग्नलिंग को बढ़ा सकता है। आश्चर्यजनक रूप से, डीईईटी, प्रयुक्त दोनों सांद्रताओं के लिए एचयूवीईसी (डेटा नहीं दिखाया गया) और एचईके/एम3 (चित्र 4ए, बी) में साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम बढ़ाने में विफल रहा।