कृमिनाशक दवा एन,एन-डाइएथिल-एम-टोलुमाइड (डीईईटी) को AChE (एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़) को बाधित करने के लिए रिपोर्ट किया गया है और अत्यधिक संवहनीकरण के कारण इसमें संभावित कार्सिनोजेनिक गुण हैं। इस पत्र में, हम दिखाते हैं कि DEET विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्तेजित करता है जो एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं, जिससे ट्यूमर का विकास बढ़ता है। DEET एंजियोजेनेसिस की ओर ले जाने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं को सक्रिय करता है, जिसमें प्रसार, प्रवास और आसंजन शामिल हैं। यह एंडोथेलियल कोशिकाओं में बढ़े हुए NO उत्पादन और VEGF अभिव्यक्ति से जुड़ा है। M3 को शांत करना या औषधीय M3 अवरोधकों का उपयोग करना इन सभी प्रभावों को समाप्त कर देता है, यह दर्शाता है कि DEET-प्रेरित एंजियोजेनेसिस M3-संवेदनशील है। M3 रिसेप्टर्स को ओवरएक्सप्रेस करने वाले एंडोथेलियल और HEK कोशिकाओं में कैल्शियम सिग्नलिंग से जुड़े प्रयोगों, साथ ही बाइंडिंग और डॉकिंग अध्ययनों से संकेत मिलता है कि DEET M3 रिसेप्टर्स के एलोस्टेरिक मॉड्यूलेटर के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, DEET AChE को रोकता है, जिससे एसिटाइलकोलाइन की जैव उपलब्धता और M3 रिसेप्टर्स से इसके बंधन में वृद्धि होती है, और एलोस्टेरिक विनियमन के माध्यम से प्रोएंजियोजेनिक प्रभावों को बढ़ाया जाता है।
प्राथमिक ECs को स्विस चूहों की महाधमनी से अलग किया गया। निष्कर्षण विधि कोबायाशी प्रोटोकॉल 26 से अनुकूलित की गई थी। म्यूरिन ECs को चौथे मार्ग तक 5% ताप-निष्क्रिय FBS के साथ पूरक EBM-2 माध्यम में संवर्धित किया गया।
HUVEC, U87MG, या BF16F10 के प्रसार पर DEET की दो सांद्रताओं के प्रभाव का विश्लेषण CyQUANT सेल प्रसार परख किट (आणविक जांच, C7026) का उपयोग करके किया गया। संक्षेप में, प्रति कुँआ 5.103 कोशिकाओं को 96-कुँआ प्लेट में बोया गया, रात भर संलग्न होने दिया गया, और फिर 24 घंटे के लिए DEET से उपचारित किया गया। वृद्धि माध्यम को हटाने के बाद, माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुँए में डाई बाइंडिंग घोल डालें और कोशिकाओं को 37 °C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 485 एनएम उत्तेजना फिल्टर और 530 एनएम उत्सर्जन फिल्टर से लैस मिथ्रास LB940 मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (बर्थोल्ड टेक्नोलॉजीज, बैड वाइल्डबैड, जर्मनी) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति स्तरों का निर्धारण किया गया।
HUVEC को 96-वेल प्लेटों में 104 कोशिकाओं प्रति वेल के घनत्व पर बोया गया। कोशिकाओं को 24 घंटे तक DEET से उपचारित किया गया। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन एक रंगमिति MTT परख (सिग्मा-एल्ड्रिच, M5655) का उपयोग करके किया गया। ऑप्टिकल घनत्व मान 570 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक मल्टीमोड माइक्रोप्लेट रीडर (मिथ्रास LB940) पर प्राप्त किए गए थे।
इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख का उपयोग करके डीईईटी के प्रभावों का अध्ययन किया गया। 10-8 एम या 10-5 एम डीईईटी के साथ उपचार ने एचयूवीईसी में केशिका लंबाई के गठन को बढ़ाया (चित्र 1 ए, बी, सफेद पट्टियाँ)। नियंत्रण समूह की तुलना में, 10-14 से 10-5 एम तक की डीईईटी सांद्रता के साथ उपचार ने दिखाया कि केशिका लंबाई 10-8 एम डीईईटी (पूरक चित्र एस 2) पर एक पठार पर पहुंच गई। 10-8 एम और 10-5 एम की सांद्रता सीमा में डीईईटी के साथ इलाज किए गए एचयूवीईसी के इन विट्रो प्रोएंजियोजेनिक प्रभाव में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।
नवसंवहनीकरण पर डीईईटी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने इन विवो नवसंवहनीकरण अध्ययन किए। 14 दिनों के बाद, 10-8 एम या 10-5 एम डीईईटी के साथ प्रीकल्चर किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन लगाए गए चूहों में हीमोग्लोबिन सामग्री में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 1 सी, सफेद पट्टियाँ)।
इसके अलावा, यू87एमजी ज़ेनोग्राफ्ट-असर वाले चूहों में डीईईटी-प्रेरित नवसंवहनीकरण का अध्ययन किया गया था, जिन्हें प्रतिदिन (आईपी) डीईईटी के साथ एक खुराक पर इंजेक्ट किया गया था, जो 10-5 एम के प्लाज्मा सांद्रता को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, जो कि उजागर मनुष्यों में सामान्य है। 23 में। चूहों में यू87एमजी कोशिकाओं के इंजेक्शन के 14 दिन बाद पता लगाने योग्य ट्यूमर (यानी ट्यूमर >100 मिमी3) देखे गए। 28वें दिन, नियंत्रण चूहों की तुलना में डीईईटी-उपचारित चूहों में ट्यूमर की वृद्धि काफी बढ़ गई थी (चित्र 1डी, वर्ग)। इसके अलावा, ट्यूमर के सीडी31 धुंधलापन ने दिखाया कि डीईईटी ने केशिका क्षेत्र में काफी वृद्धि की, लेकिन माइक्रोवेसल घनत्व में नहीं। (चित्र 1ई-जी)।
डीईटीए-प्रेरित प्रसार में मस्कैरिनिक रिसेप्टर्स की भूमिका निर्धारित करने के लिए, पीएफएचएचएसआईडी (10-7 एम, एक चयनात्मक एम3 रिसेप्टर विरोधी) की उपस्थिति में 10-8 एम या 10-5 एम डीईटीए का उपयोग किया गया था। एचयूवीईसी का उपचार। पीएफएचएचएसआईडी ने सभी सांद्रताओं पर डीईटीए के प्रसार गुणों को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया (तालिका 1)।
इन परिस्थितियों में, हमने यह भी जांच की कि क्या DEET HUVEC कोशिकाओं में केशिका की लंबाई बढ़ाएगा। इसी तरह, pFHHSiD ने DEET-प्रेरित केशिका की लंबाई को काफी हद तक रोका (चित्र 1a, b, ग्रे बार)। इसके अलावा, M3 siRNA के साथ भी इसी तरह के प्रयोग किए गए। हालाँकि नियंत्रण siRNA केशिका निर्माण को बढ़ावा देने में प्रभावी नहीं था, लेकिन M3 मस्कैरिनिक रिसेप्टर को शांत करने से DEET की केशिका की लंबाई बढ़ाने की क्षमता समाप्त हो गई (चित्र 1a, b, काली पट्टियाँ)।
इसके अलावा, 10-8 M या 10-5 M DEET-प्रेरित संवहनीकरण इन विट्रो और नव संवहनीकरण इन विवो दोनों को pFHHSiD (चित्र 1c, d, वृत्त) द्वारा पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया गया था। ये परिणाम संकेत देते हैं कि DEET चयनात्मक M3 रिसेप्टर प्रतिपक्षी या M3 siRNA के प्रति संवेदनशील मार्ग के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देता है।
एसीई डीईईटी का आणविक लक्ष्य है। डोनेपेज़िल जैसी दवाएँ, जो एसीई अवरोधकों के रूप में कार्य करती हैं, इन विट्रो में और माउस हिंडलिंब इस्केमिया मॉडल में ईसी एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित कर सकती हैं14। हमने एचयूवीईसी में एसीई एंजाइम गतिविधि पर डीईईटी की दो सांद्रताओं के प्रभाव का परीक्षण किया। नियंत्रण स्थितियों (चित्र 2) की तुलना में डीईईटी की कम (10-8 एम) और उच्च (10-5 एम) सांद्रता ने एंडोथेलियल एसीई गतिविधि को कम कर दिया।
DEET (10-8 M और 10-5 M) की दोनों सांद्रताओं ने HUVEC पर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ गतिविधि को कम कर दिया। BW284c51 (10-5 M) का उपयोग एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ अवरोधकों के लिए नियंत्रण के रूप में किया गया था। परिणाम वाहन-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में DEET की दो सांद्रताओं के साथ इलाज किए गए HUVEC पर AChE गतिविधि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। मान छह स्वतंत्र प्रयोगों के औसत ± SEM के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। * p < 0.05 नियंत्रण की तुलना में (क्रुस्कल-वालिस और डन मल्टीपल तुलना परीक्षण)।
नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) एंजियोजेनिक प्रक्रिया 33 में शामिल है, इसलिए, DEET-उत्तेजित HUVECs में NO उत्पादन का अध्ययन किया गया। DEET-उपचारित एंडोथेलियल NO उत्पादन नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में बढ़ा था, लेकिन केवल 10-8 M (चित्र 3c) की खुराक पर ही महत्व प्राप्त हुआ। DEET-प्रेरित NO उत्पादन को नियंत्रित करने वाले आणविक परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए, वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा eNOS अभिव्यक्ति और सक्रियण का विश्लेषण किया गया। हालाँकि DEET उपचार ने eNOS अभिव्यक्ति को नहीं बदला, लेकिन इसने eNOS फॉस्फोराइलेशन में अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में इसके सक्रियण स्थल (Ser-1177) पर eNOS फॉस्फोराइलेशन को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा दिया जबकि इसके निरोधक स्थल (Thr-495) को कम कर दिया (चित्र 3d)। इसके अलावा, एंजाइम की कुल मात्रा में फॉस्फोराइलेटेड eNOS की मात्रा को सामान्य करने के बाद सक्रियण स्थल और निरोधक स्थल पर फॉस्फोराइलेटेड eNOS के अनुपात की गणना की गई। डीईईटी की प्रत्येक सांद्रता के साथ उपचारित एचयूवीईसी में यह अनुपात अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में उल्लेखनीय रूप से बढ़ा था (चित्र 3डी)।
अंत में, वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा मुख्य प्रोएंजियोजेनिक कारकों में से एक, VEGF की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। DEET ने VEGF अभिव्यक्ति को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाया, जबकि pFHHSiD ने इस अभिव्यक्ति को पूरी तरह से अवरुद्ध कर दिया।
चूंकि डीईईटी के प्रभाव औषधीय अवरोध और एम3 रिसेप्टर्स के डाउनरेगुलेशन दोनों के प्रति संवेदनशील हैं, इसलिए हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया कि डीईईटी कैल्शियम सिग्नलिंग को बढ़ा सकता है। आश्चर्यजनक रूप से, डीईईटी एचयूवीईसी (डेटा नहीं दिखाया गया) और एचईके/एम3 (चित्र 4ए, बी) में इस्तेमाल की गई दोनों सांद्रताओं के लिए साइटोप्लाज्मिक कैल्शियम को बढ़ाने में विफल रहा।
पोस्ट करने का समय: दिसम्बर-30-2024