सेंट जॉन वॉर्ट में इन विट्रो ऑर्गेनोजेनेसिस और बायोएक्टिव यौगिकों के उत्पादन पर पादप वृद्धि नियामकों और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के सहक्रियात्मक प्रभाव

इस अध्ययन में, संयुक्त उपचार के उत्तेजक प्रभावों का अध्ययन किया गया है।पादप वृद्धि नियामकहाइपरिकम परफोरेटम एल. में इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस और सेकेंडरी मेटाबोलाइट उत्पादन पर 2,4-डी और काइनेटिन तथा आयरन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-एनपी) के प्रभाव का अध्ययन किया गया। अनुकूलित उपचार [2,4-डी (0.5 मिलीग्राम/लीटर) + काइनेटिन (2 मिलीग्राम/लीटर) + Fe₃O₄-एनपी (4 मिलीग्राम/लीटर)] ने पौधे की वृद्धि के मापदंडों में उल्लेखनीय सुधार किया: नियंत्रण समूह की तुलना में पौधे की ऊंचाई में 59.6%, जड़ की लंबाई में 114.0%, कलियों की संख्या में 180.0% और कैलस के ताजे वजन में 198.3% की वृद्धि हुई। इस संयुक्त उपचार ने पुनर्जनन दक्षता (50.85%) को भी बढ़ाया और हाइपरिसिन की मात्रा में 66.6% की वृद्धि की। GC-MS विश्लेषण से हाइपरोसाइड, β-पैथोलीन और सेटिल अल्कोहल की उच्च मात्रा का पता चला, जो कुल पीक क्षेत्र का 93.36% है, जबकि कुल फेनोलिक्स और फ्लेवोनोइड्स की मात्रा में 80.1% तक की वृद्धि हुई। ये परिणाम दर्शाते हैं कि पादप वृद्धि नियामक (PGRs) और Fe₃O₄ नैनोकण (Fe₃O₄-NPs) ऑर्गेनोजेनेसिस और जैवसक्रिय यौगिकों के संचय को उत्तेजित करके सहक्रियात्मक प्रभाव डालते हैं, जो औषधीय पौधों के जैव प्रौद्योगिकी सुधार के लिए एक आशाजनक रणनीति प्रस्तुत करता है।
सेंट जॉन्स वॉर्ट (हाइपरिकम परफोरेटम एल.), जिसे सेंट जॉन्स वॉर्ट के नाम से भी जाना जाता है, हाइपरिकेसी कुल का एक बारहमासी शाकीय पौधा है जिसका आर्थिक महत्व है।[1] इसके संभावित जैवसक्रिय घटकों में प्राकृतिक टैनिन, ज़ैंथोन, फ्लोरोग्लुसिनोल, नेफ्थालीनडायंथ्रोन (हाइपरिन और स्यूडोहाइपरिन), फ्लेवोनोइड, फेनोलिक अम्ल और आवश्यक तेल शामिल हैं।[2,3,4] सेंट जॉन्स वॉर्ट को पारंपरिक विधियों द्वारा उगाया जा सकता है; हालाँकि, पारंपरिक विधियों की मौसमी प्रकृति, कम बीज अंकुरण और रोगों के प्रति संवेदनशीलता बड़े पैमाने पर खेती और द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के निरंतर निर्माण की इसकी क्षमता को सीमित करती है।[1,5,6]
इस प्रकार, इन विट्रो ऊतक संवर्धन को पौधों के तीव्र प्रसार, जर्मप्लाज्म संसाधनों के संरक्षण और औषधीय यौगिकों की उपज बढ़ाने के लिए एक प्रभावी विधि माना जाता है [7, 8]। पादप वृद्धि नियामक (पीजीआर) आकारिकी को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और कैलस और संपूर्ण जीवों की इन विट्रो खेती के लिए आवश्यक हैं। इन विकासात्मक प्रक्रियाओं की सफल समाप्ति के लिए उनकी सांद्रता और संयोजनों का अनुकूलन महत्वपूर्ण है [9]। इसलिए, सेंट जॉन वॉर्ट (एच. परफोरेटम) की वृद्धि और पुनर्जनन क्षमता में सुधार के लिए नियामकों की उचित संरचना और सांद्रता को समझना महत्वपूर्ण है [10]।
आयरन ऑक्साइड नैनोकण (Fe₃O₄) नैनोकणों का एक वर्ग है जिसे ऊतक संवर्धन के लिए विकसित किया गया है या किया जा रहा है। Fe₃O₄ में महत्वपूर्ण चुंबकीय गुण, अच्छी जैव अनुकूलता और पौधों की वृद्धि को बढ़ावा देने तथा पर्यावरणीय तनाव को कम करने की क्षमता होती है, इसलिए इसने ऊतक संवर्धन डिज़ाइनों में काफी ध्यान आकर्षित किया है। इन नैनोकणों के संभावित अनुप्रयोगों में कोशिका विभाजन को बढ़ावा देने, पोषक तत्वों के अवशोषण में सुधार करने और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों को सक्रिय करने के लिए इन विट्रो संवर्धन को अनुकूलित करना शामिल हो सकता है [11]।
हालांकि नैनोकणों ने पौधों की वृद्धि पर अच्छे प्रभाव दिखाए हैं, लेकिन *एच. परफोरेटम* में Fe₃O₄ नैनोकणों और अनुकूलित पादप वृद्धि नियामकों के संयुक्त अनुप्रयोग पर अध्ययन अभी भी कम हैं। इस ज्ञान की कमी को पूरा करने के लिए, इस अध्ययन में औषधीय पौधों की विशेषताओं में सुधार के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने हेतु इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस और द्वितीयक मेटाबोलाइट उत्पादन पर उनके संयुक्त प्रभावों का मूल्यांकन किया गया। इसलिए, इस अध्ययन के दो उद्देश्य हैं: (1) इन विट्रो में कैलस निर्माण, शूट पुनर्जनन और जड़ निर्माण को प्रभावी ढंग से बढ़ावा देने के लिए पादप वृद्धि नियामकों की सांद्रता को अनुकूलित करना; और (2) इन विट्रो में वृद्धि मापदंडों पर Fe₃O₄ नैनोकणों के प्रभावों का मूल्यांकन करना। भविष्य की योजनाओं में अनुकूलन (इन विट्रो) के दौरान पुनर्जीवित पौधों की उत्तरजीविता दर का मूल्यांकन करना शामिल है। यह आशा की जाती है कि इस अध्ययन के परिणाम *एच. परफोरेटम* की सूक्ष्मप्रसार दक्षता में उल्लेखनीय सुधार करेंगे, जिससे इस महत्वपूर्ण औषधीय पौधे के सतत उपयोग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में योगदान मिलेगा।
इस अध्ययन में, हमने खेत में उगाए गए सेंट जॉन्स वॉर्ट के वार्षिक पौधों (मातृ पौधे) से पत्ती के नमूने प्राप्त किए। इन नमूनों का उपयोग इन विट्रो संवर्धन की स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए किया गया। संवर्धन से पहले, पत्तियों को कई मिनट तक बहते हुए आसुत जल के नीचे अच्छी तरह से धोया गया। इसके बाद, नमूनों की सतहों को 30 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल में डुबोकर कीटाणुरहित किया गया, फिर उन्हें कुछ बूंदें ट्विन 20 युक्त 1.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaOCl) के घोल में 10 मिनट के लिए डुबोया गया। अंत में, नमूनों को अगले संवर्धन माध्यम में स्थानांतरित करने से पहले तीन बार रोगाणु रहित आसुत जल से धोया गया।
अगले चार हफ्तों के दौरान, अंकुर पुनर्जनन दर, प्रति एक्सप्लांट अंकुरों की संख्या और अंकुर की लंबाई सहित शूट पुनर्जनन मापदंडों का मापन किया गया। जब पुनर्जनित शूट कम से कम 2 सेमी की लंबाई तक पहुँच गए, तो उन्हें अर्ध-शक्ति एमएस माध्यम, 0.5 मिलीग्राम/लीटर इंडोलब्यूट्रिक एसिड (आईबीए) और 0.3% ग्वार गम से युक्त रूटिंग माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया। रूटिंग कल्चर तीन हफ्तों तक जारी रहा, इस दौरान रूटिंग दर, जड़ों की संख्या और जड़ों की लंबाई का मापन किया गया। प्रत्येक उपचार को तीन बार दोहराया गया, जिसमें प्रति प्रतिकृति 10 एक्सप्लांट का संवर्धन किया गया, जिससे प्रति उपचार लगभग 30 एक्सप्लांट प्राप्त हुए।
पौधे की ऊँचाई को आधार से लेकर सबसे ऊँची पत्ती के सिरे तक, एक रूलर की सहायता से सेंटीमीटर (सेमी) में मापा गया। अंकुरों को सावधानीपूर्वक निकालने और वृद्धि माध्यम को हटाने के तुरंत बाद, जड़ों की लंबाई को मिलीमीटर (मिमी) में मापा गया। प्रत्येक पौधे पर कलियों की संख्या सीधे गिनी गई। पत्तियों पर मौजूद काले धब्बों (जिन्हें नोड्यूल कहा जाता है) की संख्या आँखों से देखकर मापी गई। माना जाता है कि ये काले नोड्यूल हाइपरिसिन युक्त ग्रंथियाँ या ऑक्सीडेटिव स्पॉट हैं, और इनका उपयोग पौधे की उपचार के प्रति प्रतिक्रिया के शारीरिक संकेतक के रूप में किया जाता है। सभी वृद्धि माध्यम को हटाने के बाद, अंकुरों का ताजा वजन मिलीग्राम (मिलीग्राम) की सटीकता वाले इलेक्ट्रॉनिक तराजू से मापा गया।
कैलस निर्माण की दर की गणना करने की विधि इस प्रकार है: विभिन्न वृद्धि नियामकों (काइनेज, 2,4-डी और Fe3O4) युक्त माध्यम में चार सप्ताह तक एक्सप्लांट्स को कल्चर करने के बाद, कैलस बनाने में सक्षम एक्सप्लांट्स की संख्या गिनी जाती है। कैलस निर्माण की दर की गणना करने का सूत्र इस प्रकार है:
प्रत्येक उपचार को तीन बार दोहराया गया, और प्रत्येक बार कम से कम 10 प्रत्यारोपणों की जांच की गई।
पुनर्जनन दर, कैलस निर्माण अवस्था के बाद कली विभेदन प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पूरा करने वाले कैलस ऊतक के अनुपात को दर्शाती है। यह सूचक कैलस ऊतक की विभेदित ऊतक में परिवर्तित होने और नए पादप अंगों में विकसित होने की क्षमता को प्रदर्शित करता है।
जड़ निकलने का गुणांक, जड़ निकलने में सक्षम शाखाओं की संख्या और कुल शाखाओं की संख्या का अनुपात होता है। यह सूचक जड़ निकलने की अवस्था की सफलता को दर्शाता है, जो सूक्ष्म प्रसार और पादप प्रसार में महत्वपूर्ण है, क्योंकि अच्छी तरह से जड़ निकलना पौधों को बढ़ती परिस्थितियों में बेहतर ढंग से जीवित रहने में मदद करता है।
हाइपरिसिन यौगिकों को 90% मेथनॉल से निकाला गया। 50 मिलीग्राम सूखे पौधे की सामग्री को 1 मिलीलीटर मेथनॉल में मिलाया गया और कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर (मॉडल A5120-3YJ) में 30 किलोहर्ट्ज़ पर 20 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया। सोनिकेशन के बाद, नमूने को 6000 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट को एकत्र किया गया, और कॉन्सेइको एट अल. [14] द्वारा वर्णित विधि के अनुसार प्लस-3000 एस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 592 एनएम पर हाइपरिसिन के अवशोषण को मापा गया।
पादप वृद्धि नियामकों (पीजीआर) और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (Fe₃O₄-एनपी) के साथ किए गए अधिकांश उपचारों से पुनर्जीवित टहनी की पत्तियों पर काली गांठों का निर्माण नहीं हुआ। 0.5 या 1 मिलीग्राम/लीटर 2,4-डी, 0.5 या 1 मिलीग्राम/लीटर काइनेटिन, या 1, 2, या 4 मिलीग्राम/लीटर आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के साथ किए गए किसी भी उपचार में कोई गांठ नहीं देखी गई। कुछ संयोजनों में काइनेटिन और/या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों की उच्च सांद्रता पर गांठों के विकास में थोड़ी वृद्धि देखी गई (लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं), जैसे कि 2,4-डी (0.5–2 मिलीग्राम/लीटर) का काइनेटिन (1–1.5 मिलीग्राम/लीटर) और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (2–4 मिलीग्राम/लीटर) के साथ संयोजन। ये परिणाम चित्र 2 में दर्शाए गए हैं। काली गांठें हाइपरिसिन से भरपूर ग्रंथियों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो प्राकृतिक रूप से पाई जाने वाली और लाभकारी दोनों होती हैं। इस अध्ययन में, काले नोड्यूल मुख्य रूप से ऊतकों के भूरेपन से जुड़े थे, जो हाइपरिसिन संचय के लिए अनुकूल वातावरण का संकेत देते हैं। 2,4-D, काइनेटिन और Fe₃O₄ नैनोकणों के साथ उपचार ने कैलस वृद्धि को बढ़ावा दिया, भूरेपन को कम किया और क्लोरोफिल की मात्रा में वृद्धि की, जो बेहतर चयापचय कार्य और ऑक्सीडेटिव क्षति में संभावित कमी का सुझाव देता है [37]। इस अध्ययन में सेंट जॉन वॉर्ट कैलस की वृद्धि और विकास पर 2,4-D और Fe₃O₄ नैनोकणों के साथ काइनेटिन के संयोजन के प्रभावों का मूल्यांकन किया गया (चित्र 3a-g)। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि Fe₃O₄ नैनोकणों में एंटीफंगल और एंटीमाइक्रोबियल गतिविधियाँ होती हैं [38, 39] और, जब पादप वृद्धि नियामकों के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह पादप रक्षा तंत्र को उत्तेजित कर सकता है और कोशिकीय तनाव सूचकांकों को कम कर सकता है [18]। यद्यपि द्वितीयक मेटाबोलाइट्स का जैवसंश्लेषण आनुवंशिक रूप से विनियमित होता है, उनकी वास्तविक उपज पर्यावरणीय परिस्थितियों पर अत्यधिक निर्भर करती है। चयापचय और आकारिकी में होने वाले परिवर्तन विशिष्ट पादप जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके और पर्यावरणीय कारकों के प्रति प्रतिक्रिया करके द्वितीयक चयापचय के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रेरक नए जीनों की सक्रियता को प्रेरित कर सकते हैं, जो बदले में एंजाइमी गतिविधि को उत्तेजित करते हैं, अंततः कई जैवसंश्लेषण मार्गों को सक्रिय करते हैं और द्वितीयक चयापचयों के निर्माण की ओर ले जाते हैं। इसके अलावा, एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि छाया कम करने से सूर्य के प्रकाश का संपर्क बढ़ता है, जिससे *हाइपरिकम परफोरेटम* के प्राकृतिक आवास में दिन का तापमान बढ़ जाता है, जो हाइपरिसिन की पैदावार में वृद्धि में भी योगदान देता है। इन आंकड़ों के आधार पर, इस अध्ययन ने ऊतक संवर्धन में संभावित प्रेरकों के रूप में लौह नैनोकणों की भूमिका की जांच की। परिणामों से पता चला कि ये नैनोकण एंजाइमी उत्तेजना के माध्यम से हेस्परिडिन जैवसंश्लेषण में शामिल जीनों को सक्रिय कर सकते हैं, जिससे इस यौगिक का संचय बढ़ जाता है (चित्र 2)। इसलिए, प्राकृतिक परिस्थितियों में उगने वाले पौधों की तुलना में, यह तर्क दिया जा सकता है कि जब मध्यम तनाव को द्वितीयक चयापचयों के जैवसंश्लेषण में शामिल जीनों की सक्रियता के साथ जोड़ा जाता है, तो जीवित पौधों में ऐसे यौगिकों का उत्पादन भी बढ़ाया जा सकता है। सामान्यतः, संयुक्त उपचारों का पुनर्जनन दर पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, लेकिन कुछ मामलों में यह प्रभाव कमज़ोर हो जाता है। विशेष रूप से, 1 मिलीग्राम/लीटर 2,4-डी, 1.5 मिलीग्राम/लीटर काइनेज और विभिन्न सांद्रताओं के साथ उपचार करने से नियंत्रण समूह की तुलना में पुनर्जनन दर में स्वतंत्र रूप से और महत्वपूर्ण रूप से 50.85% की वृद्धि हुई (चित्र 4c)। ये परिणाम बताते हैं कि नैनोहार्मोन के विशिष्ट संयोजन पादप वृद्धि और चयापचय उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर सकते हैं, जो औषधीय पौधों के ऊतक संवर्धन के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। पामर और केलर [50] ने दिखाया कि 2,4-डी उपचार स्वतंत्र रूप से सेंट परफोरेटम में कैलस निर्माण को प्रेरित कर सकता है, जबकि काइनेज के अतिरिक्त कैलस निर्माण और पुनर्जनन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। यह प्रभाव हार्मोनल संतुलन में सुधार और कोशिका विभाजन के उत्तेजना के कारण था। बाल एट अल. [51] ने पाया कि Fe₃O₄-एनपी उपचार स्वतंत्र रूप से एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों के कार्य को बढ़ा सकता है, जिससे सेंट परफोरेटम में जड़ वृद्धि को बढ़ावा मिलता है। 0.5 मिलीग्राम/लीटर, 1 मिलीग्राम/लीटर और 1.5 मिलीग्राम/लीटर सांद्रता पर Fe₃O₄ नैनोकणों से युक्त कल्चर मीडिया ने अलसी के पौधों की पुनर्जनन दर में सुधार किया [52]। काइनेटिन, 2,4-डाइक्लोरोबेंज़ोथियाज़ोलिनोन और Fe₃O₄ नैनोकणों के उपयोग से कैलस और जड़ निर्माण दर में उल्लेखनीय सुधार हुआ, हालांकि, इन हार्मोनों के इन विट्रो पुनर्जनन के लिए उपयोग के संभावित दुष्प्रभावों पर विचार करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, 2,4-डाइक्लोरोबेंज़ोथियाज़ोलिनोन या काइनेटिन का दीर्घकालिक या उच्च सांद्रता में उपयोग दैहिक क्लोनल भिन्नता, ऑक्सीडेटिव तनाव, असामान्य कैलस आकृति विज्ञान या विट्रीफिकेशन का कारण बन सकता है। इसलिए, उच्च पुनर्जनन दर का अर्थ यह नहीं है कि आनुवंशिक स्थिरता भी होगी। सभी पुनर्जीवित पौधों का मूल्यांकन आणविक मार्करों (जैसे RAPD, ISSR, AFLP) या साइटोजेनेटिक विश्लेषण का उपयोग करके किया जाना चाहिए ताकि उनकी समरूपता और इन विवो पौधों से समानता निर्धारित की जा सके [53,54,55]।
इस अध्ययन ने पहली बार यह प्रदर्शित किया कि पादप वृद्धि नियामकों (2,4-डी और काइनेटिन) का Fe₃O₄ नैनोकणों के साथ संयुक्त उपयोग *हाइपरिकम परफोरेटम* में आकारिकी और प्रमुख जैवसक्रिय चयापचयों (हाइपरिसिन और हाइपरोसाइड सहित) के संचय को बढ़ा सकता है। अनुकूलित उपचार पद्धति (1 मिलीग्राम/लीटर 2,4-डी + 1 मिलीग्राम/लीटर काइनेटिन + 4 मिलीग्राम/लीटर Fe₃O₄-एनपी) ने न केवल कैलस निर्माण, अंग निर्माण और द्वितीयक चयापचय की पैदावार को अधिकतम किया, बल्कि एक हल्का प्रेरक प्रभाव भी दिखाया, जिससे पौधे की तनाव सहनशीलता और औषधीय मूल्य में संभावित रूप से सुधार हो सकता है। नैनो तकनीक और पादप ऊतक संवर्धन का संयोजन औषधीय यौगिकों के बड़े पैमाने पर इन विट्रो उत्पादन के लिए एक टिकाऊ और कुशल मंच प्रदान करता है। ये परिणाम औद्योगिक अनुप्रयोगों और आणविक तंत्र, खुराक अनुकूलन और आनुवंशिक परिशुद्धता में भविष्य के अनुसंधान के लिए मार्ग प्रशस्त करते हैं, जिससे औषधीय पौधों पर मौलिक अनुसंधान को व्यावहारिक जैव प्रौद्योगिकी से जोड़ा जा सकता है।