मात्रात्मक जिबरेलिन बायोसेन्सर शूट एपिकल मेरिस्टेम में इंटरनोड विनिर्देशन में जिबरेलिन की भूमिका को उजागर करता है।

शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) की वृद्धि तने की संरचना के लिए महत्वपूर्ण है। पादप हार्मोनजिबरेलिन(GA) पौधों की वृद्धि के समन्वय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन एसएएम में उनकी भूमिका अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। यहाँ, हमने DELLA प्रोटीन को इस प्रकार इंजीनियर करके GA सिग्नलिंग का एक अनुपात-आधारित बायोसेन्सर विकसित किया है कि यह GA प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में इसके आवश्यक नियामक कार्य को दबा देता है, जबकि GA की पहचान होने पर इसका अपघटन बरकरार रहता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह अपघटन-आधारित बायोसेन्सर विकास के दौरान GA स्तरों और कोशिकीय संवेदन में होने वाले परिवर्तनों को सटीक रूप से रिकॉर्ड करता है। हमने इस बायोसेन्सर का उपयोग एसएएम में GA सिग्नलिंग गतिविधि का मानचित्रण करने के लिए किया। हम दिखाते हैं कि उच्च GA सिग्नल मुख्य रूप से अंग प्राइमोर्डिया के बीच स्थित कोशिकाओं में मौजूद होते हैं, जो इंटर्नोड कोशिकाओं के अग्रदूत होते हैं। गेन-ऑफ-फंक्शन और लॉस-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोणों का उपयोग करते हुए, हम आगे प्रदर्शित करते हैं कि GA कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है, इंटर्नोड्स के मानक कोशिकीय संगठन को स्थापित करता है, जिससे एसएएम में इंटर्नोड विशिष्टता को बढ़ावा मिलता है।
शूट एपिकल मेरिस्टेम (SAM), जो शूट के शीर्ष पर स्थित होता है, में स्टेम कोशिकाओं का एक समूह होता है जिसकी गतिविधि पौधे के जीवनकाल के दौरान एक मॉड्यूलर और पुनरावृत्ति तरीके से पार्श्व अंगों और तने की गांठों को उत्पन्न करती है। इनमें से प्रत्येक दोहराई जाने वाली इकाई, या पादप गांठ, में गांठों पर अंतरनाड और पार्श्व अंग तथा पत्ती के कक्षों में कक्षीय मेरिस्टेम शामिल होते हैं।1 विकास के दौरान पादप गांठों की वृद्धि और संगठन में परिवर्तन होता है। अरेबिडोप्सिस में, वानस्पतिक अवस्था के दौरान अंतरनाड की वृद्धि अवरुद्ध हो जाती है, और कक्षीय मेरिस्टेम रोसेट पत्तियों के कक्षों में निष्क्रिय अवस्था में रहते हैं। पुष्पीय अवस्था में संक्रमण के दौरान, SAM पुष्पक्रम मेरिस्टेम बन जाता है, जिससे लम्बी अंतरनाड और कक्षीय कलियाँ, तने की पत्तियों के कक्षों में शाखाएँ और बाद में, पत्ती रहित फूल उत्पन्न होते हैं।2 यद्यपि हमने पत्तियों, फूलों और शाखाओं के आरंभ को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति की है, फिर भी अंतरनाड कैसे उत्पन्न होते हैं, इसके बारे में अपेक्षाकृत कम जानकारी है।
जीए के स्थानिक-कालिक वितरण को समझने से विभिन्न ऊतकों और विकास के विभिन्न चरणों में इन हार्मोनों के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। अपने स्वयं के प्रमोटर की क्रिया के तहत व्यक्त आरजीए-जीएफपी संलयन के क्षरण का दृश्यण जड़ों में कुल जीए स्तरों के नियमन पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है15,16। हालांकि, आरजीए अभिव्यक्ति ऊतकों में भिन्न होती है17 और जीए द्वारा विनियमित होती है18। इस प्रकार, आरजीए प्रमोटर की विभेदक अभिव्यक्ति आरजीए-जीएफपी के साथ देखे गए प्रतिदीप्ति पैटर्न का परिणाम हो सकती है और इसलिए यह विधि मात्रात्मक नहीं है। हाल ही में, जैवसक्रिय फ्लोरेसिन (एफएल)-लेबल जीए19,20 ने जड़ एंडोकोर्टेक्स में जीए के संचय और जीए परिवहन द्वारा इसके कोशिकीय स्तरों के नियमन का खुलासा किया। हाल ही में, जीए एफआरईटी सेंसर एनएलएसजीपीएस1 ने दिखाया कि जीए स्तर जड़ों, तंतुओं और अंधेरे में उगाए गए हाइपोकोटाइल में कोशिका विस्तार के साथ सहसंबंधित हैं21। हालांकि, जैसा कि हमने देखा है, GA सांद्रता GA सिग्नलिंग गतिविधि को नियंत्रित करने वाला एकमात्र पैरामीटर नहीं है, क्योंकि यह जटिल संवेदन प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। यहां, DELLA और GA सिग्नलिंग मार्गों की हमारी समझ के आधार पर, हम GA सिग्नलिंग के लिए एक निम्नीकरण-आधारित अनुपात-आधारित बायोसेन्सर के विकास और लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं। इस मात्रात्मक बायोसेन्सर को विकसित करने के लिए, हमने एक उत्परिवर्ती GA-संवेदनशील RGA का उपयोग किया, जिसे एक प्रतिदीप्त प्रोटीन के साथ संलयनित किया गया था और ऊतकों में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया गया था, साथ ही एक GA-असंवेदनशील प्रतिदीप्त प्रोटीन का भी उपयोग किया। हम दिखाते हैं कि उत्परिवर्ती RGA प्रोटीन संलयन सर्वव्यापी रूप से व्यक्त होने पर अंतर्जात GA सिग्नलिंग में हस्तक्षेप नहीं करते हैं, और यह बायोसेन्सर उच्च स्थानिक-कालिक संकल्प के साथ संवेदन उपकरण द्वारा GA इनपुट और GA सिग्नल प्रसंस्करण दोनों से उत्पन्न सिग्नलिंग गतिविधि को मात्रात्मक रूप से निर्धारित कर सकता है। हमने इस बायोसेन्सर का उपयोग GA सिग्नलिंग गतिविधि के स्थानिक-कालिक वितरण का मानचित्रण करने और SAM एपिडर्मिस में GA द्वारा कोशिकीय व्यवहार के नियमन को निर्धारित करने के लिए किया। हमने प्रदर्शित किया कि GA अंग प्राइमोर्डिया के बीच स्थित SAM कोशिकाओं के विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है, जिससे इंटरनोड की मानक कोशिकीय संरचना परिभाषित होती है।
अंत में, हमने यह जानने का प्रयास किया कि क्या qmRGA बढ़ते हुए हाइपोकोटाइल का उपयोग करके अंतर्जात GA स्तरों में परिवर्तन की रिपोर्ट कर सकता है। हमने पहले दिखाया था कि नाइट्रेट GA संश्लेषण को बढ़ाकर और बदले में, DELLA34 के अपघटन को बढ़ाकर वृद्धि को उत्तेजित करता है। तदनुसार, हमने पाया कि प्रचुर मात्रा में नाइट्रेट आपूर्ति (10 mM NO3−) के अंतर्गत उगाए गए pUBQ10::qmRGA पौधों में हाइपोकोटाइल की लंबाई नाइट्रेट की कमी वाली परिस्थितियों में उगाए गए पौधों की तुलना में काफी अधिक थी (पूरक चित्र 6a)। वृद्धि प्रतिक्रिया के अनुरूप, 10 mM NO3− परिस्थितियों में उगाए गए पौधों के हाइपोकोटाइल में GA संकेत नाइट्रेट की अनुपस्थिति में उगाए गए पौधों की तुलना में अधिक थे (पूरक चित्र 6b, c)। इस प्रकार, qmRGA अंतर्जात GA सांद्रता में परिवर्तन द्वारा प्रेरित GA सिग्नलिंग में परिवर्तन की निगरानी करने में भी सक्षम बनाता है।
यह समझने के लिए कि क्या qmRGA द्वारा पता लगाई गई GA सिग्नलिंग गतिविधि, सेंसर डिज़ाइन के आधार पर अपेक्षित रूप से, GA सांद्रता और GA बोध पर निर्भर करती है, हमने वानस्पतिक और प्रजनन ऊतकों में तीन GID1 रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। अंकुरों में, GID1-GUS रिपोर्टर लाइन ने दिखाया कि GID1a और c बीजपत्रों में उच्च स्तर पर व्यक्त होते हैं (चित्र 3a–c)। इसके अतिरिक्त, तीनों रिसेप्टर्स पत्तियों, पार्श्व जड़ प्रवर्धन, जड़ युक्तियों (GID1b के जड़ टोपी को छोड़कर) और संवहनी तंत्र में व्यक्त होते हैं (चित्र 3a–c)। पुष्पक्रम SAM में, हमने केवल GID1b और 1c के लिए GUS सिग्नल का पता लगाया (पूरक चित्र 7a–c)। इन सीटू संकरण ने इन अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि की और आगे प्रदर्शित किया कि GID1c SAM में कम स्तर पर समान रूप से व्यक्त होता है, जबकि GID1b SAM की परिधि पर उच्च अभिव्यक्ति दिखाता है (पूरक चित्र 7d–l)। pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रांसलेशनल फ्यूजन ने GID1b अभिव्यक्ति की एक श्रेणीबद्ध सीमा भी प्रकट की, जो SAM के केंद्र में कम या नगण्य अभिव्यक्ति से लेकर अंग सीमाओं पर उच्च अभिव्यक्ति तक थी (पूरक चित्र 7m)। इस प्रकार, GID1 रिसेप्टर ऊतकों में और उनके भीतर समान रूप से वितरित नहीं होते हैं। बाद के प्रयोगों में, हमने यह भी देखा कि GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) के अति-अभिव्यक्ति ने हाइपोकोटाइल में qmRGA की संवेदनशीलता को बाहरी GA अनुप्रयोग के प्रति बढ़ा दिया (चित्र 3d, e)। इसके विपरीत, हाइपोकोटाइल में qd17mRGA द्वारा मापी गई प्रतिदीप्ति GA3 उपचार के प्रति असंवेदनशील थी (चित्र 3f, g)। दोनों परीक्षणों के लिए, अंकुरों को GA की उच्च सांद्रता (100 μM GA3) के साथ उपचारित किया गया ताकि सेंसर के तीव्र व्यवहार का आकलन किया जा सके, जहाँ GID1 रिसेप्टर से जुड़ने की क्षमता में वृद्धि या हानि देखी गई। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि qmRGA बायोसेन्सर GA और GA सेंसर के रूप में एक संयुक्त कार्य करता है, और यह सुझाव देते हैं कि GID1 रिसेप्टर की विभेदक अभिव्यक्ति सेंसर की उत्सर्जन क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से नियंत्रित कर सकती है।
आज तक, एसएएम में जीए संकेतों का वितरण स्पष्ट नहीं है। इसलिए, हमने qmRGA-व्यक्त करने वाले पौधों और pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 का उपयोग करके जीए सिग्नलिंग गतिविधि के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मात्रात्मक मानचित्रों की गणना की, जिसमें एल1 परत (एपिडर्मिस; चित्र 4a, b, विधियाँ और पूरक विधियाँ देखें) पर ध्यान केंद्रित किया गया, क्योंकि एल1 एसएएम वृद्धि को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है36। यहाँ, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्ति ने जीए सिग्नलिंग गतिविधि के स्थानिक-सामयिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक निश्चित ज्यामितीय संदर्भ बिंदु प्रदान किया37। यद्यपि जीए को पार्श्व अंग विकास के लिए आवश्यक माना जाता है4, हमने देखा कि पुष्पीय प्राइमोर्डियम (P) में जीए संकेत P3 चरण से कम थे (चित्र 4a, b), जबकि युवा P1 और P2 प्राइमोर्डियम में केंद्रीय क्षेत्र के समान मध्यम गतिविधि थी (चित्र 4a, b)। अंग प्राइमोर्डियम की सीमाओं पर, P1/P2 (सीमा के किनारों पर) से शुरू होकर P4 पर चरम पर पहुँचने वाली, साथ ही प्राइमोर्डियम के बीच स्थित परिधीय क्षेत्र की सभी कोशिकाओं में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का पता चला (चित्र 4a, b और पूरक चित्र 8a, b)। यह उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि न केवल एपिडर्मिस में बल्कि L2 और ऊपरी L3 परतों में भी देखी गई (पूरक चित्र 8b)। qmRGA का उपयोग करके SAM में पता लगाए गए GA संकेतों का पैटर्न भी समय के साथ अपरिवर्तित रहा (पूरक चित्र 8c–f, k)। यद्यपि qd17mRGA कंस्ट्रक्ट को पाँच स्वतंत्र लाइनों के T3 पौधों के SAM में व्यवस्थित रूप से डाउनरेगुलेट किया गया था, जिनका हमने विस्तार से विश्लेषण किया, फिर भी हम pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP कंस्ट्रक्ट से प्राप्त फ्लोरेसेंस पैटर्न का विश्लेषण करने में सक्षम थे (पूरक चित्र 8g–j, l)। इस नियंत्रण रेखा में, SAM में प्रतिदीप्ति अनुपात में केवल मामूली परिवर्तन देखे गए, लेकिन SAM केंद्र में हमने TagBFP से जुड़े VENUS में एक स्पष्ट और अप्रत्याशित कमी देखी। यह पुष्टि करता है कि qmRGA द्वारा देखा गया सिग्नलिंग पैटर्न mRGA-VENUS के GA-निर्भर क्षरण को दर्शाता है, लेकिन यह भी दर्शाता है कि qmRGA मेरिस्टेम केंद्र में GA सिग्नलिंग गतिविधि का अधिक अनुमान लगा सकता है। संक्षेप में, हमारे परिणाम एक GA सिग्नलिंग पैटर्न को प्रकट करते हैं जो मुख्य रूप से प्राइमोर्डिया के वितरण को दर्शाता है। अंतर-प्राइमोर्डियल क्षेत्र (IPR) का यह वितरण विकसित हो रहे प्राइमोर्डियम और केंद्रीय क्षेत्र के बीच उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि की क्रमिक स्थापना के कारण होता है, जबकि साथ ही प्राइमोर्डियम में GA सिग्नलिंग गतिविधि कम हो जाती है (चित्र 4c, d)।
GID1b और GID1c रिसेप्टर्स का वितरण (ऊपर देखें) यह दर्शाता है कि GA रिसेप्टर्स की भिन्न अभिव्यक्ति SAM में GA सिग्नलिंग गतिविधि के पैटर्न को आकार देने में सहायक होती है। हमने सोचा कि क्या GA का भिन्न संचय इसमें शामिल हो सकता है। इस संभावना की जांच करने के लिए, हमने nlsGPS1 GA FRET सेंसर21 का उपयोग किया। 100 मिनट के लिए 10 μM GA4+7 के साथ उपचारित nlsGPS1 के SAM में सक्रियण आवृत्ति में वृद्धि देखी गई (पूरक चित्र 9a–e), जो दर्शाता है कि nlsGPS1, जड़ों की तरह ही, SAM में GA सांद्रता में परिवर्तन पर प्रतिक्रिया करता है21। nlsGPS1 सक्रियण आवृत्ति के स्थानिक वितरण से SAM की बाहरी परतों में GA का स्तर अपेक्षाकृत कम पाया गया, लेकिन यह भी पता चला कि SAM के केंद्र और किनारों पर GA का स्तर अधिक था (चित्र 4e और पूरक चित्र 9a,c)। इससे पता चलता है कि GA, SAM में भी qmRGA द्वारा प्रकट किए गए स्थानिक पैटर्न के समान वितरित होता है। पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हमने SAM को फ्लोरोसेंट GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) या केवल Fl के साथ नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपचारित किया। Fl सिग्नल SAM के केंद्रीय क्षेत्र और प्राइमोर्डियम सहित पूरे क्षेत्र में वितरित था, हालांकि इसकी तीव्रता कम थी (चित्र 4j और पूरक चित्र 10d)। इसके विपरीत, तीनों GA-Fl विशेष रूप से प्राइमोर्डियम की सीमाओं के भीतर और शेष IPR में अलग-अलग मात्रा में जमा हुए, जिसमें GA7-Fl IPR के सबसे बड़े क्षेत्र में जमा हुआ (चित्र 4k और पूरक चित्र 10a,b)। फ्लोरोसेंस तीव्रता के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि GA-Fl से उपचारित SAM में IPR और गैर-IPR की तीव्रता का अनुपात Fl से उपचारित SAM की तुलना में अधिक था (चित्र 4l और पूरक चित्र 10c)। ये परिणाम बताते हैं कि GA उन IPR कोशिकाओं में उच्च सांद्रता में मौजूद होता है जो अंग की सीमा के सबसे निकट स्थित होती हैं। इससे पता चलता है कि SAM GA सिग्नलिंग गतिविधि का पैटर्न GA रिसेप्टर्स की भिन्न अभिव्यक्ति और अंग सीमाओं के पास IPR कोशिकाओं में GA के भिन्न संचय, दोनों के परिणामस्वरूप होता है। इस प्रकार, हमारे विश्लेषण ने GA सिग्नलिंग का एक अप्रत्याशित स्थानिक-कालिक पैटर्न प्रकट किया, जिसमें SAM के केंद्र और प्रारंभिक भाग में गतिविधि कम और परिधीय क्षेत्र में IPR में गतिविधि अधिक पाई गई।
SAM में विभेदक GA सिग्नलिंग गतिविधि की भूमिका को समझने के लिए, हमने SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS की रीयल-टाइम टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग करके GA सिग्नलिंग गतिविधि, कोशिका विस्तार और कोशिका विभाजन के बीच सहसंबंध का विश्लेषण किया। वृद्धि नियमन में GA की भूमिका को देखते हुए, कोशिका विस्तार मापदंडों के साथ एक सकारात्मक सहसंबंध अपेक्षित था। इसलिए, हमने सबसे पहले GA सिग्नलिंग गतिविधि मानचित्रों की तुलना कोशिका सतह वृद्धि दर के मानचित्रों (किसी दी गई कोशिका और विभाजन के समय पुत्री कोशिकाओं के लिए कोशिका विस्तार की शक्ति के एक संकेतक के रूप में) और वृद्धि विषमता के मानचित्रों से की, जो कोशिका विस्तार की दिशात्मकता को मापता है (यहाँ भी किसी दी गई कोशिका और विभाजन के समय पुत्री कोशिकाओं के लिए उपयोग किया गया है; चित्र 5a,b, विधियाँ और पूरक विधियाँ देखें)। SAM कोशिका सतह वृद्धि दर के हमारे मानचित्र पिछले प्रेक्षणों38,39 के अनुरूप हैं, जिसमें सीमा पर न्यूनतम वृद्धि दर और विकासशील फूलों में अधिकतम वृद्धि दर पाई जाती है (चित्र 5a)। प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) से पता चला कि GA सिग्नलिंग गतिविधि कोशिका सतह वृद्धि तीव्रता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित थी (चित्र 5c)। हमने यह भी दिखाया कि GA सिग्नलिंग इनपुट और वृद्धि तीव्रता सहित भिन्नता के मुख्य अक्ष, उच्च CLV3 अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित दिशा के लंबवत थे, जो शेष विश्लेषणों में SAM केंद्र से कोशिकाओं के बहिष्करण की पुष्टि करता है। स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण ने PCA परिणामों की पुष्टि की (चित्र 5d), यह दर्शाता है कि IPR में उच्च GA सिग्नल के परिणामस्वरूप उच्च कोशिका विस्तार नहीं हुआ। हालांकि, सहसंबंध विश्लेषण ने GA सिग्नलिंग गतिविधि और वृद्धि विषमता के बीच एक मामूली सकारात्मक सहसंबंध दिखाया (चित्र 5c, d), यह सुझाव देता है कि IPR में उच्च GA सिग्नलिंग कोशिका वृद्धि की दिशा और संभवतः कोशिका विभाजन तल की स्थिति को प्रभावित करती है।
a, b सात स्वतंत्र पौधों पर औसत SAM में औसत सतह वृद्धि (a) और वृद्धि विषमता (b) के हीट मैप (क्रमशः कोशिका विस्तार की शक्ति और दिशा के लिए प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किए गए)। c पीसीए विश्लेषण में निम्नलिखित चर शामिल थे: GA सिग्नल, सतह वृद्धि तीव्रता, सतह वृद्धि विषमता और CLV3 अभिव्यक्ति। पीसीए घटक 1 मुख्य रूप से सतह वृद्धि तीव्रता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित था और GA सिग्नल के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। पीसीए घटक 2 मुख्य रूप से सतह वृद्धि विषमता के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित था और CLV3 अभिव्यक्ति के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। प्रतिशत प्रत्येक घटक द्वारा समझाई गई भिन्नता को दर्शाते हैं। d CZ को छोड़कर ऊतक स्तर पर GA सिग्नल, सतह वृद्धि तीव्रता और सतह वृद्धि विषमता के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण। दाईं ओर की संख्या दो चरों के बीच स्पीयरमैन rho मान है। तारांकन चिह्न उन मामलों को इंगित करते हैं जहां सहसंबंध/नकारात्मक सहसंबंध अत्यधिक महत्वपूर्ण है। e कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा Col-0 SAM L1 कोशिकाओं का 3D दृश्यीकरण। 10 घंटे पर SAM (लेकिन प्राइमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका भित्तियों को उनके कोणीय मानों के अनुसार रंगीन किया गया है। रंग पट्टी निचले दाहिने कोने में दिखाई गई है। इंसर्ट 0 घंटे पर संबंधित 3D छवि दिखाता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। बॉक्स प्लॉट IPR और गैर-IPR Col-0 SAM (n = 10 स्वतंत्र पौधे) में कोशिका विभाजन दरों को दर्शाते हैं। केंद्र रेखा माध्यिका को दर्शाती है, और बॉक्स की सीमाएँ 25वें और 75वें प्रतिशतक को इंगित करती हैं। व्हिस्कर्स R सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित न्यूनतम और अधिकतम मानों को दर्शाते हैं। P मान वेल्च के दो-पूंछ वाले t-परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। चित्र g और h में योजनाबद्ध आरेख दर्शाए गए हैं: (g) एसएएम के केंद्र (सफेद बिंदीदार रेखा) से त्रिज्या दिशा के सापेक्ष नई कोशिका भित्ति (मैजेंटा) के कोण को मापने का तरीका (केवल न्यून कोण मान, यानी 0-90°, पर विचार किया गया है), और (h) मेरिस्टेम के भीतर परिधीय/पार्श्व और त्रिज्या दिशाएँ। चित्र i में क्रमशः एसएएम (गहरा नीला), आईपीआर (मध्यम नीला) और गैर-आईपीआर (हल्का नीला) के पार कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम दर्शाए गए हैं। पी मान दो-तरफ़ा कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। चित्र j में क्रमशः पी3 (हल्का हरा), पी4 (मध्यम हरा) और पी5 (गहरा हरा) के आसपास आईपीआर के कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम दर्शाए गए हैं। पी मान दो-तरफ़ा कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया।
इसलिए, हमने आगे GA सिग्नलिंग और कोशिका विभाजन गतिविधि के बीच सहसंबंध की जांच करने के लिए परख के दौरान नवगठित कोशिका भित्तियों की पहचान की (चित्र 5e)। इस दृष्टिकोण ने हमें कोशिका विभाजन की आवृत्ति और दिशा को मापने की अनुमति दी। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि IPR और शेष SAM (गैर-IPR, चित्र 5f) में कोशिका विभाजन की आवृत्ति समान थी, जो दर्शाता है कि IPR और गैर-IPR कोशिकाओं के बीच GA सिग्नलिंग में अंतर कोशिका विभाजन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। यह, और GA सिग्नलिंग और वृद्धि विषमता के बीच सकारात्मक सहसंबंध ने हमें यह विचार करने के लिए प्रेरित किया कि क्या GA सिग्नलिंग गतिविधि कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित कर सकती है। हमने मेरिस्टेम केंद्र और नई कोशिका भित्ति के केंद्र को जोड़ने वाले रेडियल अक्ष के सापेक्ष एक न्यून कोण के रूप में नई कोशिका भित्ति के अभिविन्यास को मापा (चित्र 5e-i) और रेडियल अक्ष के सापेक्ष 90° के करीब कोणों पर कोशिकाओं के विभाजन की स्पष्ट प्रवृत्ति देखी, जिसमें उच्चतम आवृत्तियाँ 70-80° (23.28%) और 80-90° (22.62%) पर देखी गईं (चित्र 5e,i), जो परिधीय/अनुप्रस्थ दिशा में कोशिका विभाजन के अनुरूप हैं (चित्र 5h)। इस कोशिका विभाजन व्यवहार में GA सिग्नलिंग के योगदान की जांच करने के लिए, हमने IPR और गैर-IPR में कोशिका विभाजन मापदंडों का अलग-अलग विश्लेषण किया (चित्र 5i)। हमने देखा कि IPR कोशिकाओं में विभाजन कोण का वितरण गैर-IPR कोशिकाओं या संपूर्ण SAM की कोशिकाओं से भिन्न था, जिसमें IPR कोशिकाओं में पार्श्व/वृत्ताकार कोशिका विभाजनों का अनुपात अधिक था, अर्थात् 70-80° और 80-90° (क्रमशः 33.86% और 30.71%) (चित्र 5i)। इस प्रकार, हमारे प्रेक्षणों से उच्च GA सिग्नलिंग और परिधीय दिशा के निकट कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के बीच एक संबंध का पता चला, जो GA सिग्नलिंग गतिविधि और वृद्धि विषमता के बीच सहसंबंध के समान है (चित्र 5c, d)। इस संबंध के स्थानिक संरक्षण को और स्थापित करने के लिए, हमने P3 से शुरू होने वाले प्राइमोर्डियम के आसपास की IPR कोशिकाओं में विभाजन तल अभिविन्यास को मापा, क्योंकि P4 से शुरू होने वाले इस क्षेत्र में उच्चतम GA सिग्नलिंग गतिविधि का पता चला था (चित्र 4)। P3 और P4 के आसपास IPR के विभाजन कोणों में सांख्यिकीय रूप से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा, हालांकि P4 के आसपास IPR में पार्श्व कोशिका विभाजनों की आवृत्ति में वृद्धि देखी गई (चित्र 5j)। हालांकि, P5 के आसपास IPR कोशिकाओं में, कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो गया, जिसमें अनुप्रस्थ कोशिका विभाजनों की आवृत्ति में तीव्र वृद्धि हुई (चित्र 5j)। कुल मिलाकर, ये परिणाम बताते हैं कि GA सिग्नलिंग SAM में कोशिका विभाजनों के अभिविन्यास को नियंत्रित कर सकती है, जो पिछली रिपोर्टों40,41 के अनुरूप है कि उच्च GA सिग्नलिंग IPR में कोशिका विभाजनों के पार्श्व अभिविन्यास को प्रेरित कर सकती है।
यह अनुमान लगाया गया है कि आईपीआर में कोशिकाएं प्राइमोर्डिया में शामिल नहीं होंगी, बल्कि इंटर्नोड्स2,42,43 में शामिल होंगी। आईपीआर में कोशिका विभाजन का अनुप्रस्थ अभिविन्यास इंटर्नोड्स में एपिडर्मल कोशिकाओं की समानांतर अनुदैर्ध्य पंक्तियों के विशिष्ट संगठन का परिणाम हो सकता है। ऊपर वर्णित हमारे अवलोकन बताते हैं कि जीए सिग्नलिंग कोशिका विभाजन की दिशा को विनियमित करके इस प्रक्रिया में भूमिका निभाता है।
कई DELLA जीनों के कार्य में कमी के परिणामस्वरूप एक निरंतर GA प्रतिक्रिया होती है, और इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए डेला म्यूटेंट का उपयोग किया जा सकता है44। हमने सबसे पहले SAM में पाँच DELLA जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया। GUS लाइन45 के ट्रांसक्रिप्शनल संलयन से पता चला कि GAI, RGA, RGL1 और RGL2 (काफी कम मात्रा में) SAM में व्यक्त होते हैं (पूरक चित्र 11a–d)। इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन ने आगे प्रदर्शित किया कि GAI mRNA विशेष रूप से प्राइमोर्डिया और विकसित हो रहे फूलों में जमा होता है (पूरक चित्र 11e)। RGL1 और RGL3 mRNA पूरे SAM कैनोपी और पुराने फूलों में पाए गए, जबकि RGL2 mRNA सीमा क्षेत्र में अधिक मात्रा में था (पूरक चित्र 11f–h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM की कॉन्फोकल इमेजिंग ने इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन द्वारा देखी गई अभिव्यक्ति की पुष्टि की और दिखाया कि RGL3 प्रोटीन SAM के केंद्रीय भाग में जमा होता है (पूरक चित्र 11i)। pRGA::GFP-RGA लाइन का उपयोग करते हुए, हमने यह भी पाया कि RGA प्रोटीन SAM में जमा होता है, लेकिन P4 से शुरू होकर सीमा पर इसकी प्रचुरता कम हो जाती है (पूरक चित्र 11j)। विशेष रूप से, RGL3 और RGA के अभिव्यक्ति पैटर्न IPR में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि के अनुरूप हैं, जैसा कि qmRGA द्वारा पता लगाया गया है (चित्र 4)। इसके अलावा, ये आंकड़े इंगित करते हैं कि सभी DELLA SAM में व्यक्त होते हैं और उनकी अभिव्यक्ति सामूहिक रूप से संपूर्ण SAM में फैली हुई है।
इसके बाद हमने वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियंत्रण) और gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della क्विंटुपल (ग्लोबल) म्यूटेंट में कोशिका विभाजन मापदंडों का विश्लेषण किया (चित्र 6a, b)। दिलचस्प बात यह है कि हमने वाइल्ड-टाइप की तुलना में della ग्लोबल म्यूटेंट SAM में कोशिका विभाजन कोण आवृत्तियों के वितरण में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बदलाव देखा (चित्र 6c)। della ग्लोबल म्यूटेंट में यह बदलाव 80-90° कोणों की आवृत्ति में वृद्धि (34.71% बनाम 24.55%) और कुछ हद तक 70-80° कोणों की आवृत्ति में वृद्धि (23.78% बनाम 20.18%) के कारण था, यानी अनुप्रस्थ कोशिका विभाजनों के अनुरूप (चित्र 6c)। गैर-अनुप्रस्थ विभाजनों (0-60°) की आवृत्ति भी della ग्लोबल म्यूटेंट में कम थी (चित्र 6c)। डेला ग्लोबल म्यूटेंट के एसएएम में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 6b)। आईपीआर में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति भी वाइल्ड टाइप की तुलना में डेला ग्लोबल म्यूटेंट में अधिक थी (चित्र 6d)। आईपीआर क्षेत्र के बाहर, वाइल्ड टाइप में कोशिका विभाजन कोणों का वितरण अधिक समान था, जबकि डेला ग्लोबल म्यूटेंट ने आईपीआर की तरह स्पर्शरेखीय विभाजन को प्राथमिकता दी (चित्र 6e)। हमने GA2 ऑक्सीडेज (ga2ox) क्विंटुपल म्यूटेंट (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, और ga2ox6-2) के एसएएम में कोशिका विभाजन के अभिविन्यास का भी मात्रात्मक विश्लेषण किया, जो एक GA-निष्क्रिय म्यूटेंट पृष्ठभूमि है जिसमें GA का संचय होता है। GA के स्तर में वृद्धि के अनुरूप, पंचगुणित ga2ox उत्परिवर्ती पुष्पक्रम का SAM, Col-0 की तुलना में बड़ा था (पूरक चित्र 12a, b), और Col-0 की तुलना में, पंचगुणित ga2ox SAM ने कोशिका विभाजन कोणों का एक स्पष्ट रूप से भिन्न वितरण दिखाया, जिसमें कोण आवृत्ति 50° से 90° तक बढ़ गई, यानी फिर से स्पर्शरेखीय विभाजनों को बढ़ावा दिया (पूरक चित्र 12a–c)। इस प्रकार, हम यह दर्शाते हैं कि GA सिग्नलिंग की निरंतर सक्रियता और GA संचय, IPR और शेष SAM में पार्श्व कोशिका विभाजनों को प्रेरित करते हैं।
a, b PI-रंजित Ler (a) और वैश्विक della उत्परिवर्ती (b) SAM की L1 परत का 3D दृश्य-विज़ुअलाइज़ेशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया है। 10 घंटे की अवधि में SAM (लेकिन प्राइमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका भित्तियों को उनके कोणीय मानों के अनुसार दर्शाया गया है। इनसेट में 0 घंटे पर SAM दिखाया गया है। रंग पट्टी निचले दाहिने कोने में प्रदर्शित है। (b) में तीर वैश्विक della उत्परिवर्ती में संरेखित कोशिका भित्तियों के एक उदाहरण को इंगित करता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। ce Ler और वैश्विक della के बीच संपूर्ण SAM (d), IPR (e), और गैर-IPR (f) में कोशिका विभाजन तल अभिविन्यासों के आवृत्ति वितरण की तुलना। P मान दो-पूंछ वाले कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। चित्र f और g में Col-0 (i) और pCUC2::gai-1-VENUS (j) ट्रांसजेनिक पौधों के PI-रंजित SAM की कॉन्फोकल छवियों का 3D दृश्य दिखाया गया है। पैनल (a और b) में 10 घंटे के भीतर SAM में बनी नई कोशिका भित्तियाँ (लेकिन प्राइमोर्डिया नहीं) दर्शाई गई हैं। प्रयोग को दो बार दोहराया गया और परिणाम समान रहे। चित्र h-j में Col-0 और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के बीच संपूर्ण SAM (h), IPR (i) और गैर-IPR (j) में स्थित कोशिका विभाजन तल अभिविन्यासों के आवृत्ति वितरण की तुलना की गई है। P मान दो-तरफ़ा कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।
इसके बाद हमने विशेष रूप से आईपीआर में जीए सिग्नलिंग को बाधित करने के प्रभाव का परीक्षण किया। इसके लिए, हमने वीनस से जुड़े एक प्रमुख नकारात्मक गाई-1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को संचालित करने के लिए कॉटिलेडन कप 2 (सीयूसी2) प्रमोटर का उपयोग किया (pCUC2::gai-1-VENUS लाइन में)। वाइल्ड-टाइप एसएएम में, सीयूसी2 प्रमोटर पी4 से आगे बॉर्डर कोशिकाओं सहित एसएएम में अधिकांश आईपीआर की अभिव्यक्ति को संचालित करता है, और इसी तरह की विशिष्ट अभिव्यक्ति pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में भी देखी गई (नीचे देखें)। pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के एसएएम या आईपीआर में कोशिका विभाजन कोणों का वितरण वाइल्ड टाइप से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था, हालांकि अप्रत्याशित रूप से हमने पाया कि इन पौधों में आईपीआर के बिना कोशिकाएं 80-90 डिग्री की उच्च आवृत्ति पर विभाजित होती हैं (चित्र 6f-j)।
यह सुझाव दिया गया है कि कोशिका विभाजन की दिशा एसएएम की ज्यामिति पर निर्भर करती है, विशेष रूप से ऊतक वक्रता द्वारा उत्पन्न तनाव पर46। इसलिए हमने यह जानने का प्रयास किया कि क्या डेला ग्लोबल म्यूटेंट और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में एसएएम का आकार परिवर्तित होता है। जैसा कि पहले बताया गया है12, डेला ग्लोबल म्यूटेंट एसएएम का आकार वाइल्ड टाइप की तुलना में बड़ा था (पूरक चित्र 13a, b, d)। CLV3 और STM RNA के इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन ने डेला म्यूटेंट में मेरिस्टेम विस्तार की पुष्टि की और स्टेम सेल निके के पार्श्व विस्तार को भी दर्शाया (पूरक चित्र 13e, f, h, i)। हालांकि, दोनों जीनोटाइप में एसएएम वक्रता समान थी (पूरक चित्र 13k, m, n, p)। हमने वाइल्ड टाइप की तुलना में gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della क्वाड्रपल म्यूटेंट में वक्रता में कोई परिवर्तन किए बिना आकार में इसी तरह की वृद्धि देखी (पूरक चित्र 13c, d, g, j, l, o, p)। della क्वाड्रपल म्यूटेंट में कोशिका विभाजन अभिविन्यास की आवृत्ति भी प्रभावित हुई, लेकिन della मोनोलिथिक म्यूटेंट की तुलना में कम हद तक (पूरक चित्र 12d–f)। यह डोज़ेज प्रभाव, वक्रता पर प्रभाव की कमी के साथ, यह बताता है कि Della क्वाड्रपल म्यूटेंट में अवशिष्ट RGL3 गतिविधि, DELLA गतिविधि की हानि के कारण होने वाले कोशिका विभाजन अभिविन्यास में परिवर्तन को सीमित करती है और पार्श्व कोशिका विभाजन में परिवर्तन SAM ज्यामिति में परिवर्तन के बजाय GA सिग्नलिंग गतिविधि में परिवर्तन के कारण होते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, CUC2 प्रमोटर P4 से शुरू होने वाले SAM में IPR अभिव्यक्ति को संचालित करता है (पूरक चित्र 14a, b), और इसके विपरीत, pCUC2::gai-1-VENUS SAM का आकार छोटा था लेकिन वक्रता अधिक थी (पूरक चित्र 14c–h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM की आकृति में यह परिवर्तन, वाइल्ड टाइप की तुलना में यांत्रिक तनावों के भिन्न वितरण का कारण बन सकता है, जिसमें उच्च परिधीय तनाव SAM केंद्र से कम दूरी पर शुरू होते हैं47। वैकल्पिक रूप से, pCUC2::gai-1-VENUS SAM की आकृति में परिवर्तन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित क्षेत्रीय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के कारण हो सकते हैं48। दोनों ही मामलों में, यह परिधीय/अनुप्रस्थ अभिविन्यास में कोशिकाओं के विभाजन की संभावना को बढ़ाकर GA सिग्नलिंग में परिवर्तनों के प्रभावों को आंशिक रूप से कम कर सकता है, जिससे हमारे प्रेक्षणों की व्याख्या होती है।
कुल मिलाकर, हमारे आंकड़े इस बात की पुष्टि करते हैं कि उच्च GA सिग्नलिंग, IPR में कोशिका विभाजन तल के पार्श्व अभिविन्यास में सक्रिय भूमिका निभाती है। वे यह भी दर्शाते हैं कि मेरिस्टेम वक्रता भी IPR में कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित करती है।
उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि के कारण IPR में विभाजन तल का अनुप्रस्थ अभिविन्यास यह दर्शाता है कि GA, SAM के भीतर एपिडर्मिस में एक रेडियल कोशिका पंक्ति को पूर्व-व्यवस्थित करता है ताकि उस कोशिकीय संरचना को परिभाषित किया जा सके जो बाद में एपिडर्मल इंटरनोड में पाई जाएगी। वास्तव में, ऐसी कोशिका पंक्तियाँ डेला ग्लोबल म्यूटेंट के SAM चित्रों में अक्सर दिखाई देती थीं (चित्र 6b)। इसलिए, SAM में GA सिग्नलिंग के स्थानिक पैटर्न के विकासात्मक कार्य का और अधिक पता लगाने के लिए, हमने वाइल्ड-टाइप (Ler और Col-0), डेला ग्लोबल म्यूटेंट और pCUC2::gai-1-VENUS ट्रांसजेनिक पौधों में IPR में कोशिकाओं की स्थानिक संरचना का विश्लेषण करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग किया।
हमने पाया कि qmRGA ने दर्शाया कि IPR में GA सिग्नलिंग गतिविधि P1/P2 से बढ़ती है और P4 पर चरम पर पहुँचती है, और यह पैटर्न समय के साथ स्थिर रहता है (चित्र 4a–f और पूरक चित्र 8c–f, k)। बढ़ते GA सिग्नल के साथ IPR में कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए, हमने P4 के ऊपर और किनारों पर स्थित Ler IPR कोशिकाओं को उनके विकासात्मक भाग्य के अनुसार लेबल किया, जिसका विश्लेषण पहली बार अवलोकन के 34 घंटे बाद किया गया, यानी दो प्लास्टिड समय से अधिक, जिससे हमें P1/P2 से P4 तक प्राइमोर्डियम विकास के दौरान IPR कोशिकाओं का अनुसरण करने की अनुमति मिली। हमने तीन अलग-अलग रंगों का उपयोग किया: पीले रंग का उपयोग उन कोशिकाओं के लिए किया जो P4 के पास प्राइमोर्डियम में एकीकृत थीं, हरे रंग का उपयोग उन कोशिकाओं के लिए किया जो IPR में थीं, और बैंगनी रंग का उपयोग उन कोशिकाओं के लिए किया जो दोनों प्रक्रियाओं में भाग लेती थीं (चित्र 7a–c)। t0 (0 घंटे) पर, P4 के सामने IPR कोशिकाओं की 1-2 परतें दिखाई दे रही थीं (चित्र 7a)। जैसा कि अपेक्षित था, जब इन कोशिकाओं का विभाजन हुआ, तो यह मुख्य रूप से अनुप्रस्थ विभाजन तल के माध्यम से हुआ (चित्र 7a–c)। Col-0 SAM का उपयोग करके भी समान परिणाम प्राप्त हुए (P3 पर ध्यान केंद्रित करते हुए, जिसकी सीमा Ler में P4 के समान ही मुड़ती है), हालांकि इस जीनोटाइप में पुष्प सीमा पर बनने वाली तह ने IPR कोशिकाओं को अधिक तेज़ी से छिपा दिया (चित्र 7g–i)। इस प्रकार, IPR कोशिकाओं का विभाजन पैटर्न कोशिकाओं को अंतःनोड्स की तरह ही रेडियल पंक्तियों में पूर्व-व्यवस्थित करता है। रेडियल पंक्तियों का संगठन और क्रमिक अंगों के बीच IPR कोशिकाओं का स्थान यह दर्शाता है कि ये कोशिकाएँ अंतःनोडल पूर्वज कोशिकाएँ हैं।
यहां, हमने एक अनुपात-आधारित GA सिग्नलिंग बायोसेन्सर, qmRGA विकसित किया है, जो अंतर्जात सिग्नलिंग मार्गों में हस्तक्षेप को कम करते हुए, संयुक्त GA और GA रिसेप्टर सांद्रता से उत्पन्न GA सिग्नलिंग गतिविधि की मात्रात्मक मैपिंग की अनुमति देता है, जिससे कोशिकीय स्तर पर GA कार्यप्रणाली की जानकारी मिलती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक संशोधित DELLA प्रोटीन, mRGA का निर्माण किया है, जिसने DELLA इंटरैक्शन पार्टनर्स से जुड़ने की क्षमता खो दी है, लेकिन GA-प्रेरित प्रोटीओलिसिस के प्रति संवेदनशील बना हुआ है। qmRGA GA स्तरों में बाह्य और अंतर्जात दोनों परिवर्तनों पर प्रतिक्रिया करता है, और इसके गतिशील संवेदन गुण विकास के दौरान GA सिग्नलिंग गतिविधि में स्थानिक-सामयिक परिवर्तनों के आकलन को सक्षम बनाते हैं। qmRGA एक बहुत ही लचीला उपकरण भी है क्योंकि इसे इसकी अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रमोटर को बदलकर (यदि आवश्यक हो) विभिन्न ऊतकों के अनुकूल बनाया जा सकता है, और एंजियोस्पर्म में GA सिग्नलिंग मार्ग और PFYRE रूपांकन की संरक्षित प्रकृति को देखते हुए, यह अन्य प्रजातियों में भी स्थानांतरित होने की संभावना है।22 इसी के अनुरूप, चावल के SLR1 DELLA प्रोटीन (HYY497AAA) में एक समतुल्य उत्परिवर्तन भी SLR1 की वृद्धि अवरोधक गतिविधि को दबाता हुआ पाया गया, जबकि mRGA23 के समान इसके GA-मध्यस्थता वाले अपघटन में केवल मामूली कमी आई। उल्लेखनीय रूप से, अरेबिडोप्सिस में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PFYRE डोमेन (S474L) में एक एकल अमीनो अम्ल उत्परिवर्तन ने RGA की प्रतिलेखन गतिविधि को बदल दिया, लेकिन प्रतिलेखन कारक भागीदारों के साथ इसकी अंतःक्रिया करने की क्षमता को प्रभावित नहीं किया50। यद्यपि यह उत्परिवर्तन mRGA में मौजूद 3 अमीनो अम्ल प्रतिस्थापनों के बहुत करीब है, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि ये दो उत्परिवर्तन DELLA की विशिष्ट विशेषताओं को बदलते हैं। यद्यपि अधिकांश प्रतिलेखन कारक भागीदार DELLA26,51 के LHR1 और SAW डोमेन से बंधते हैं, PFYRE डोमेन में कुछ संरक्षित अमीनो अम्ल इन अंतःक्रियाओं को स्थिर करने में मदद कर सकते हैं।
इंटरनोड का विकास पादप संरचना और उपज सुधार में एक महत्वपूर्ण विशेषता है। qmRGA ने IPR इंटरनोड प्रोजेनिटर कोशिकाओं में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का खुलासा किया। मात्रात्मक इमेजिंग और आनुवंशिकी को मिलाकर, हमने दिखाया कि GA सिग्नलिंग पैटर्न SAM एपिडर्मिस में वृत्ताकार/अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन तलों पर आरोपित होते हैं, जो इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक कोशिका विभाजन संगठन को आकार देते हैं। विकास के दौरान कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के कई नियामकों की पहचान की गई है52,53। हमारा कार्य इस बात का स्पष्ट उदाहरण प्रस्तुत करता है कि GA सिग्नलिंग गतिविधि इस कोशिकीय पैरामीटर को कैसे नियंत्रित करती है। DELLA प्रीफोल्डिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स41 के साथ परस्पर क्रिया कर सकता है, इसलिए GA सिग्नलिंग कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास40,41,54,55 को सीधे प्रभावित करके कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास को नियंत्रित कर सकता है। हमने अप्रत्याशित रूप से दिखाया कि SAM में, उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का सहसंबंध कोशिका विस्तार या विभाजन नहीं था, बल्कि केवल वृद्धि विषमता थी, जो IPR में कोशिका विभाजन की दिशा पर GA के प्रत्यक्ष प्रभाव के अनुरूप है। हालाँकि, हम इस संभावना को खारिज नहीं कर सकते कि यह प्रभाव अप्रत्यक्ष भी हो सकता है, उदाहरण के लिए GA-प्रेरित कोशिका भित्ति के नरम होने के कारण।56 कोशिका भित्ति के गुणों में परिवर्तन यांत्रिक तनाव उत्पन्न करते हैं57,58, जो कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के अभिविन्यास को प्रभावित करके कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को भी प्रभावित कर सकता है39,46,59। GA-प्रेरित यांत्रिक तनाव और GA द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास के प्रत्यक्ष विनियमन के संयुक्त प्रभाव, इंटर्नोड्स को परिभाषित करने के लिए IPR में कोशिका विभाजन अभिविन्यास का एक विशिष्ट पैटर्न उत्पन्न करने में शामिल हो सकते हैं, और इस विचार का परीक्षण करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है। इसी प्रकार, पिछले अध्ययनों ने इंटर्नोड निर्माण के नियंत्रण में DELLA-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन TCP14 और 15 के महत्व पर प्रकाश डाला है60,61 और ये कारक BREVIPEDICELLUS (BP) और PENNYWISE (PNY) के साथ मिलकर GA की क्रिया को मध्यस्थ कर सकते हैं, जो इंटर्नोड विकास को नियंत्रित करते हैं और GA सिग्नलिंग को प्रभावित करने के लिए दिखाए गए हैं2,62। यह देखते हुए कि DELLA ब्रासिनोस्टेरॉइड, एथिलीन, जैस्मोनिक एसिड और एब्सिसिक एसिड (ABA) सिग्नलिंग पाथवे63,64 के साथ इंटरैक्ट करते हैं और ये हार्मोन माइक्रोट्यूब्यूल ओरिएंटेशन को प्रभावित कर सकते हैं65, कोशिका विभाजन अभिविन्यास पर GA के प्रभाव अन्य हार्मोन द्वारा भी मध्यस्थ हो सकते हैं।
प्रारंभिक कोशिकावैज्ञानिक अध्ययनों से पता चला कि अरेबिडोप्सिस एसएएम के आंतरिक और बाहरी दोनों क्षेत्र इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक हैं2,42। यह तथ्य कि जीए आंतरिक ऊतकों में कोशिका विभाजन को सक्रिय रूप से नियंत्रित करता है12, एसएएम में मेरिस्टेम और इंटरनोड के आकार को नियंत्रित करने में जीए के दोहरे कार्य का समर्थन करता है। दिशात्मक कोशिका विभाजन का पैटर्न भी आंतरिक एसएएम ऊतक में कड़ाई से नियंत्रित होता है, और यह विनियमन तने की वृद्धि के लिए आवश्यक है52। यह जांच करना दिलचस्प होगा कि क्या जीए आंतरिक एसएएम संरचना में कोशिका विभाजन तल को उन्मुख करने में भी भूमिका निभाता है, जिससे एसएएम के भीतर इंटरनोड के विशिष्टीकरण और विकास का समन्वय होता है।
पौधों को मानक परिस्थितियों (16 घंटे प्रकाश, 22 डिग्री सेल्सियस) में मिट्टी या 1x मुराशीगे-स्कोओग (एमएस) माध्यम (डुचेफा) में 1% सुक्रोज और 1% अगर (सिग्मा) मिलाकर इन विट्रो उगाया गया। हाइपोकोटाइल और जड़ वृद्धि प्रयोगों को छोड़कर, जिनमें पौधों को स्थिर प्रकाश और 22 डिग्री सेल्सियस तापमान पर ऊर्ध्वाधर प्लेटों पर उगाया गया था। नाइट्रेट प्रयोगों के लिए, पौधों को पर्याप्त नाइट्रेट (0 या 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-सक्सिनेट, 1% सुक्रोज और 1% A-अगर (सिग्मा) मिलाकर संशोधित एमएस माध्यम (बायोवर्ल्ड प्लांट मीडियम) पर लंबी दिन की परिस्थितियों में उगाया गया।
pDONR221 में सम्मिलित GID1a cDNA को pDONR P4-P1R-pUBQ10 और pDONR P2R-P3-mCherry के साथ pB7m34GW में पुनर्संयोजित करके pUBQ10::GID1a-mCherry बनाया गया। इसी प्रकार, pDONR221 में सम्मिलित IDD2 DNA को pB7RWG266 में पुनर्संयोजित करके p35S:IDD2-RFP बनाया गया। pGID1b::2xmTQ2-GID1b उत्पन्न करने के लिए, GID1b कोडिंग क्षेत्र के ऊपर स्थित 3.9 kb खंड और GID1b cDNA (1.3 kb) और टर्मिनेटर (3.4 kb) युक्त 4.7 kb खंड को पहले पूरक तालिका 3 में दिए गए प्राइमर का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया और फिर क्रमशः pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) और pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) में डाला गया, और अंत में गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करके pDONR221 2xmTQ268 के साथ pGreen 012567 लक्ष्य वेक्टर में पुनर्संयोजित किया गया। pCUC2::LSSmOrange उत्पन्न करने के लिए, CUC2 प्रमोटर अनुक्रम (ATG से 3229 bp ऊपर) के बाद N7 नाभिकीय स्थानीयकरण संकेत और NOS प्रतिलेखन टर्मिनेटर के साथ बड़े स्टोक्स-शिफ्टेड mOrange (LSSmOrange)69 के कोडिंग अनुक्रम को गेटवे 3-खंड पुनर्संयोजन प्रणाली (इनविट्रोजन) का उपयोग करके pGreen कैनामाइसिन लक्ष्यीकरण वेक्टर में संयोजित किया गया। पादप बाइनरी वेक्टर को एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस स्ट्रेन GV3101 में और निकोटियाना बेंथैमियाना की पत्तियों में एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ विधि द्वारा तथा अरेबिडोप्सिस थैलिआना Col-0 में पुष्प डुबकी विधि द्वारा क्रमशः प्रवेश कराया गया। pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry तथा pCLV3::mCherry-NLS qmRGA को क्रमशः संबंधित संकरणों की F3 और F1 संततियों से पृथक किया गया।
लगभग 1 सेमी लंबे शूट टिप्स72 पर आरएनए इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन किया गया, जिन्हें एकत्र किया गया और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ठंडा किए गए एफएए घोल (3.7% फॉर्मेल्डिहाइड, 5% एसिटिक एसिड, 50% इथेनॉल) में स्थिर किया गया। 2 × 15 मिनट के वैक्यूम उपचार के बाद, फिक्सेटिव को बदल दिया गया और नमूनों को रात भर इनक्यूबेट किया गया। जीआईडी1ए, जीआईडी1बी, जीआईडी1सी, जीएआई, आरजीएल1, आरजीएल2 और आरजीएल3 सीडीएनए और उनके 3'-यूटीआर के लिए एंटीसेंस प्रोब को सप्लीमेंट्री टेबल 3 में दिखाए गए प्राइमर का उपयोग करके संश्लेषित किया गया, जैसा कि रोसियर एट अल.73 द्वारा वर्णित है। डिगॉक्सिजेनिन-लेबल वाले प्रोब का इम्यूनोडिटेक्शन डिगॉक्सिजेनिन एंटीबॉडी (3000 गुना तनुकरण; रोश, कैटलॉग संख्या: 11 093 274 910) का उपयोग करके किया गया था, और सेक्शन को 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी, 250 गुना तनुकरण)/नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी, 200 गुना तनुकरण) घोल से रंगा गया था।