मात्रात्मक जिबरेलिन बायोसेंसर ने शूट एपिकल मेरिस्टेम में इंटरनोड विनिर्देशन में जिबरेलिन की भूमिका का खुलासा किया

तने की संरचना के लिए प्ररोह शीर्षस्थ विभज्योतक (SAM) की वृद्धि महत्वपूर्ण है। पादप हार्मोनजिबरेलिन(GAs) पौधों की वृद्धि के समन्वय में प्रमुख भूमिका निभाते हैं, लेकिन SAM में उनकी भूमिका को अभी भी ठीक से समझा नहीं गया है। यहां, हमने GA ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया में इसके आवश्यक नियामक कार्य को दबाने के लिए DELLA प्रोटीन की इंजीनियरिंग करके GA सिग्नलिंग का एक अनुपातमितीय बायोसेंसर विकसित किया है, जबकि GA पहचान पर इसके क्षरण को संरक्षित किया है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह क्षरण-आधारित बायोसेंसर विकास के दौरान GA स्तरों और कोशिकीय संवेदन में परिवर्तनों को सटीक रूप से रिकॉर्ड करता है। हमने SAM में GA सिग्नलिंग गतिविधि को मैप करने के लिए इस बायोसेंसर का उपयोग किया। हम दिखाते हैं कि उच्च GA सिग्नल मुख्य रूप से अंग प्राइमोर्डिया के बीच स्थित कोशिकाओं में मौजूद होते हैं, जो इंटरनोड कोशिकाओं के अग्रदूत होते हैं। लाभ- और हानि-कार्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके, हम आगे प्रदर्शित करते हैं कि GA कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है
प्ररोह शीर्ष पर स्थित प्ररोह शीर्षस्थ विभज्योतक (SAM) में स्टेम कोशिकाओं का एक निकेत होता है, जिसकी क्रियाशीलता पौधे के पूरे जीवनकाल में एक मॉड्यूलर और पुनरावृत्तीय तरीके से पार्श्व अंगों और स्टेम नोड्स का निर्माण करती है। इन पुनरावर्ती इकाइयों, या पादप नोड्स में से प्रत्येक में नोड्स पर इंटरनोड्स और पार्श्व अंग, और पत्ती के कक्षों में अक्षीय विभज्योतक शामिल होते हैं1। विकास के दौरान पादप नोड्स की वृद्धि और संगठन में परिवर्तन होता है। अरेबिडोप्सिस में, वानस्पतिक अवस्था के दौरान इंटरनोड्स वृद्धि दब जाती है, और कक्षीय विभज्योतक रोसेट पत्तियों के कक्षों में निष्क्रिय रहते हैं। पुष्प अवस्था में संक्रमण के दौरान, SAM पुष्पक्रम विभज्योतक बन जाता है, जिससे दीर्घ इंटरनोड्स और कक्षीय कलियाँ, फूलगोभी के पत्तों के कक्षों में शाखाएँ, और बाद में, पत्तीविहीन पुष्प2 उत्पन्न होते हैं। यद्यपि हमने पत्तियों, पुष्पों और शाखाओं के आरंभ को नियंत्रित करने वाली क्रियाविधि को समझने में उल्लेखनीय प्रगति की है, फिर भी इंटरनोड्स कैसे उत्पन्न होते हैं, इसके बारे में अपेक्षाकृत कम जानकारी है।
GAs के स्थानिक-कालिक वितरण को समझने से विभिन्न ऊतकों और विभिन्न विकासात्मक चरणों में इन हार्मोनों के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। अपने स्वयं के प्रमोटर की क्रिया के तहत व्यक्त RGA-GFP संलयन के क्षरण का दृश्यीकरण जड़ों में कुल GA स्तरों के नियमन पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है15,16। हालाँकि, RGA अभिव्यक्ति ऊतकों में भिन्न होती है17 और GA18 द्वारा नियंत्रित होती है। इस प्रकार, RGA प्रमोटर की विभेदक अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप RGA-GFP के साथ देखे गए प्रतिदीप्ति पैटर्न हो सकते हैं और इस प्रकार यह विधि मात्रात्मक नहीं है। हाल ही में, बायोएक्टिव फ्लोरेसिन (Fl)-लेबल वाले GA19,20 ने जड़ एंडोकॉर्टेक्स में GA के संचय और GA परिवहन द्वारा इसके कोशिकीय स्तरों के नियमन का खुलासा किया हालांकि, जैसा कि हमने देखा है, GA सांद्रता GA सिग्नलिंग गतिविधि को नियंत्रित करने वाला एकमात्र पैरामीटर नहीं है, क्योंकि यह जटिल संवेदन प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। यहां, DELLA और GA सिग्नलिंग मार्गों की हमारी समझ के आधार पर, हम GA सिग्नलिंग के लिए एक क्षरण-आधारित अनुपातमितीय बायोसेंसर के विकास और लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं। इस मात्रात्मक बायोसेंसर को विकसित करने के लिए, हमने एक उत्परिवर्ती GA-संवेदनशील RGA का उपयोग किया जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़ा था और ऊतकों में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया गया था, साथ ही एक GA-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी। हम दिखाते हैं कि उत्परिवर्ती RGA प्रोटीन संलयन अंतर्जात GA सिग्नलिंग में हस्तक्षेप नहीं करते हैं जब सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जाता है, और यह बायोसेंसर उच्च स्थानिक-समय विभेदन के साथ संवेदन उपकरण द्वारा GA इनपुट और GA सिग्नल प्रोसेसिंग दोनों से उत्पन्न सिग्नलिंग गतिविधि को माप सकता है। हमने इस बायोसेंसर का उपयोग GA सिग्नलिंग गतिविधि के स्थानिक-कालिक वितरण का मानचित्रण करने और यह मापने के लिए किया कि GA SAM एपिडर्मिस में कोशिकीय व्यवहार को कैसे नियंत्रित करता है। हमने प्रदर्शित किया कि GA, अंग प्राइमोर्डिया के बीच स्थित SAM कोशिकाओं के विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है, जिससे इंटरनोड का प्रामाणिक कोशिकीय संगठन परिभाषित होता है।
अंत में, हमने पूछा कि क्या qmRGA बढ़ते हुए हाइपोकोटाइल्स का उपयोग करके अंतर्जात GA स्तरों में परिवर्तनों की रिपोर्ट कर सकता है। हमने पहले दिखाया था कि नाइट्रेट GA संश्लेषण को बढ़ाकर और बदले में, DELLA34 के क्षरण को बढ़ाकर वृद्धि को उत्तेजित करता है। तदनुसार, हमने देखा कि प्रचुर नाइट्रेट आपूर्ति (10 mM NO3−) के तहत उगाए गए pUBQ10::qmRGA पौधों में हाइपोकोटाइल की लंबाई नाइट्रेट की कमी वाली परिस्थितियों में उगाए गए पौधों की तुलना में काफी लंबी थी (पूरक चित्र 6a)। वृद्धि प्रतिक्रिया के अनुरूप, 10 mM NO3− परिस्थितियों में उगाए गए पौधों के हाइपोकोटाइल में GA संकेत नाइट्रेट की अनुपस्थिति में उगाए गए पौधों की तुलना में अधिक थे (पूरक चित्र 6b, c)। इस प्रकार, qmRGA GA सांद्रता में अंतर्जात परिवर्तनों द्वारा प्रेरित GA संकेतन में परिवर्तनों की निगरानी को भी सक्षम बनाता है।
यह समझने के लिए कि क्या qmRGA द्वारा पता लगाई गई GA सिग्नलिंग गतिविधि GA सांद्रता और GA धारणा पर निर्भर करती है, जैसा कि सेंसर डिज़ाइन के आधार पर अपेक्षित था, हमने वनस्पति और प्रजनन ऊतकों में तीन GID1 रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। अंकुरों में, GID1-GUS रिपोर्टर लाइन ने दिखाया कि GID1a और c कोटिलेडोन (चित्र 3a-c) में अत्यधिक व्यक्त किया गया था। इसके अलावा, सभी तीन रिसेप्टर्स पत्तियों, पार्श्व रूट प्राइमोर्डिया, रूट टिप्स (GID1b की रूट कैप को छोड़कर) और संवहनी प्रणाली (चित्र 3a-c) में व्यक्त किए गए थे। पुष्पक्रम SAM में, हमने केवल GID1b और 1c (पूरक चित्र 7a-c) के लिए GUS संकेतों का पता लगाया। इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन ने इन अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि की pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रांसलेशनल फ़्यूज़न ने GID1b अभिव्यक्ति की एक क्रमिक श्रेणी भी प्रकट की, SAM के केंद्र में निम्न या शून्य अभिव्यक्ति से लेकर अंग सीमाओं पर उच्च अभिव्यक्ति तक (पूरक चित्र 7m)। इस प्रकार, GID1 रिसेप्टर ऊतकों में और उनके भीतर समान रूप से वितरित नहीं होते हैं। बाद के प्रयोगों में, हमने यह भी देखा कि GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) की अधिक अभिव्यक्ति ने हाइपोकोटाइल में qmRGA की बाहरी GA अनुप्रयोग के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ा दिया (चित्र 3d, e)। इसके विपरीत, हाइपोकोटाइल में qd17mRGA द्वारा मापी गई प्रतिदीप्ति GA3 उपचार के प्रति असंवेदनशील थी (चित्र 3f, g)। दोनों परीक्षणों के लिए, सेंसर के तीव्र व्यवहार का आकलन करने के लिए पौधों को GA (100 μM GA3) की उच्च सांद्रता से उपचारित किया गया, जहाँ GID1 रिसेप्टर से जुड़ने की क्षमता बढ़ी या खो गई। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि qmRGA बायोसेंसर GA और GA सेंसर के रूप में एक संयुक्त कार्य करता है, और सुझाव देता है कि GID1 रिसेप्टर की विभेदक अभिव्यक्ति सेंसर की उत्सर्जन क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से नियंत्रित कर सकती है।
आज तक, SAM में GA संकेतों का वितरण अस्पष्ट बना हुआ है। इसलिए, हमने qmRGA-व्यक्त करने वाले पौधों और pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 का उपयोग करके GA संकेतन गतिविधि के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मात्रात्मक मानचित्रों की गणना की, जिसमें L1 परत (एपिडर्मिस; चित्र 4a, b, विधियाँ और पूरक विधियाँ देखें) पर ध्यान केंद्रित किया गया, क्योंकि L1 SAM वृद्धि36 को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहाँ, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्ति ने GA संकेतन गतिविधि37 के स्थानिक-कालिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक निश्चित ज्यामितीय संदर्भ बिंदु प्रदान किया। यद्यपि पार्श्व अंग विकास4 के लिए GA को आवश्यक माना जाता है, हमने देखा कि P3 चरण (चित्र 4a, b) से शुरू होकर पुष्प प्राइमोर्डियम (P) में GA संकेत कम थे, जबकि युवा P1 और P2 प्राइमोर्डियम में मध्य क्षेत्र (चित्र 4a, b) के समान मध्यम गतिविधि थी। अंग प्राइमोर्डियम सीमाओं पर उच्च GA संकेतन गतिविधि पाई गई, जो P1/P2 (सीमा के किनारों पर) से शुरू होकर P4 पर चरम पर पहुँची, साथ ही प्राइमोर्डियम के बीच स्थित परिधीय क्षेत्र की सभी कोशिकाओं में भी (चित्र 4a, b और अनुपूरक चित्र 8a, b)। यह उच्च GA संकेतन गतिविधि न केवल बाह्यत्वचा में, बल्कि L2 और ऊपरी L3 परतों में भी देखी गई (अनुपूरक चित्र 8b)। qmRGA का उपयोग करके SAM में पाए गए GA संकेतों का पैटर्न भी समय के साथ अपरिवर्तित रहा (अनुपूरक चित्र 8c-f, k)। हालाँकि qd17mRGA संरचना को पाँच स्वतंत्र वंशों से प्राप्त T3 पौधों के SAM में व्यवस्थित रूप से कम किया गया था, जिनका हमने विस्तार से वर्णन किया है, हम pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP संरचना से प्राप्त प्रतिदीप्ति पैटर्न का विश्लेषण करने में सक्षम थे (अनुपूरक चित्र 8g-j, l)। इस नियंत्रण रेखा में, SAM में प्रतिदीप्ति अनुपात में केवल मामूली परिवर्तन पाए गए, लेकिन SAM केंद्र में हमने TagBFP से संबद्ध VENUS में एक स्पष्ट और अप्रत्याशित कमी देखी। यह पुष्टि करता है कि qmRGA द्वारा देखा गया संकेतन पैटर्न mRGA-VENUS के GA-निर्भर क्षरण को दर्शाता है, लेकिन यह भी दर्शाता है कि qmRGA विभज्योतक केंद्र में GA संकेतन गतिविधि का अति-आकलन कर सकता है। संक्षेप में, हमारे परिणाम एक GA संकेतन पैटर्न प्रकट करते हैं जो मुख्य रूप से आदिम के वितरण को दर्शाता है। अंतर-आदिम क्षेत्र (IPR) का यह वितरण विकासशील आदिम और केंद्रीय क्षेत्र के बीच उच्च GA संकेतन गतिविधि की क्रमिक स्थापना के कारण होता है, जबकि साथ ही आदिम में GA संकेतन गतिविधि कम हो जाती है (चित्र 4c, d)।
GID1b और GID1c रिसेप्टर्स का वितरण (ऊपर देखें) यह सुझाव देता है कि GA रिसेप्टर्स की भिन्न अभिव्यक्ति SAM में GA सिग्नलिंग गतिविधि के पैटर्न को आकार देने में मदद करती है। हम सोच रहे थे कि क्या GA का भिन्न संचय इसमें शामिल हो सकता है। इस संभावना की जाँच के लिए, हमने nlsGPS1 GA FRET सेंसर21 का उपयोग किया। 100 मिनट तक 10 μM GA4+7 से उपचारित nlsGPS1 के SAM में बढ़ी हुई सक्रियण आवृत्ति पाई गई (पूरक चित्र 9a-e), जो दर्शाता है कि nlsGPS1 SAM में GA सांद्रता में परिवर्तन के प्रति उसी प्रकार प्रतिक्रिया करता है, जैसा वह जड़ों में करता है21। nlsGPS1 सक्रियण आवृत्ति के स्थानिक वितरण ने SAM की बाहरी परतों में अपेक्षाकृत कम GA स्तरों का खुलासा किया, लेकिन यह दर्शाया कि वे SAM के केंद्र और सीमाओं पर बढ़े हुए थे (चित्र 4e और पूरक चित्र 9a,c)। इससे पता चलता है कि GA भी SAM में qmRGA द्वारा प्रकट किए गए स्थानिक पैटर्न के तुलनीय स्थानिक पैटर्न के साथ वितरित किया जाता है। एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हमने SAM को फ्लोरोसेंट GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) या केवल Fl को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी उपचारित किया। Fl संकेत पूरे SAM में वितरित किया गया था, जिसमें केंद्रीय क्षेत्र और प्रिमोर्डियम भी शामिल था, यद्यपि कम तीव्रता पर (चित्र 4j और अनुपूरक चित्र 10d)। इसके विपरीत, सभी तीन GA-Fl विशेष रूप से प्रिमोर्डियम सीमाओं के भीतर और शेष IPR में अलग-अलग डिग्री तक जमा हुए, जिसमें GA7-Fl IPR में सबसे बड़े डोमेन में जमा हुआ (चित्र 4k और अनुपूरक चित्र 10a,b)। प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिमाणीकरण से पता चला कि Fl-उपचारित SAM की तुलना में GA-Fl-उपचारित SAM में IPR से गैर-IPR तीव्रता का अनुपात अधिक था (चित्र 4l और अनुपूरक चित्र 10c)। इससे पता चलता है कि एसएएम जीए सिग्नलिंग गतिविधि का पैटर्न जीए रिसेप्टर्स की विभेदक अभिव्यक्ति और अंग सीमाओं के पास आईपीआर कोशिकाओं में जीए के विभेदक संचय, दोनों से उत्पन्न होता है। इस प्रकार, हमारे विश्लेषण से जीए सिग्नलिंग का एक अप्रत्याशित स्थानिक-कालिक पैटर्न सामने आया, जिसमें एसएएम के केंद्र और प्राइमोर्डियम में कम गतिविधि और परिधीय क्षेत्र में आईपीआर में अधिक गतिविधि थी।
SAM में विभेदक GA संकेतन गतिविधि की भूमिका को समझने के लिए, हमने SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS की वास्तविक समय अंतराल इमेजिंग का उपयोग करके GA संकेतन गतिविधि, कोशिका विस्तार और कोशिका विभाजन के बीच संबंध का विश्लेषण किया। वृद्धि नियमन में GA की भूमिका को देखते हुए, कोशिका विस्तार मापदंडों के साथ एक सकारात्मक संबंध अपेक्षित था। इसलिए, हमने सबसे पहले GA संकेतन गतिविधि मानचित्रों की तुलना कोशिका सतह वृद्धि दर के मानचित्रों (किसी दी गई कोशिका के लिए और विभाजन के समय संतति कोशिकाओं के लिए कोशिका विस्तार की शक्ति के प्रॉक्सी के रूप में) और वृद्धि विषमता के मानचित्रों से की, जो कोशिका विस्तार की दिशा को मापता है (जिसका उपयोग यहां किसी दी गई कोशिका और विभाजन के समय संतति कोशिकाओं के लिए भी किया गया है; चित्र 5a,b, विधियां और पूरक विधियां देखें)। SAM कोशिका सतह वृद्धि दर के हमारे मानचित्र पिछले अवलोकनों38,39 के अनुरूप हैं, जिनमें सीमा पर न्यूनतम वृद्धि दर और विकासशील फूलों में अधिकतम वृद्धि दर है (चित्र 5a)। प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) ने दर्शाया कि जीए संकेतन गतिविधि कोशिका सतह वृद्धि तीव्रता (चित्र 5c) के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध थी। हमने यह भी दर्शाया कि जीए संकेतन इनपुट और वृद्धि तीव्रता सहित भिन्नता के मुख्य अक्ष, उच्च सीएलवी3 अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित दिशा के लंबवत थे, जिससे शेष विश्लेषणों में एसएएम केंद्र से कोशिकाओं के बहिष्करण की पुष्टि हुई। स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण ने पीसीए परिणामों (चित्र 5d) की पुष्टि की, यह दर्शाता है कि आईपीआर में उच्च जीए संकेतों के परिणामस्वरूप उच्च कोशिका विस्तार नहीं हुआ। हालाँकि, सहसंबंध विश्लेषण ने जीए संकेतन गतिविधि और वृद्धि विषमता (चित्र 5c, d) के बीच एक मामूली सकारात्मक सहसंबंध प्रकट किया, जो दर्शाता है कि आईपीआर में उच्च जीए संकेतन कोशिका वृद्धि की दिशा और संभवतः कोशिका विभाजन तल की स्थिति को प्रभावित करता है।
a, b SAM में औसत सतही वृद्धि (a) और वृद्धि विषमता (b) के हीट मैप्स सात स्वतंत्र पौधों (क्रमशः कोशिका विस्तार की ताकत और दिशा के लिए प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किए जाते हैं) पर आधारित हैं। c PCA विश्लेषण में निम्नलिखित चर शामिल हैं: GA संकेत, सतही वृद्धि तीव्रता, सतही वृद्धि विषमता और CLV3 अभिव्यक्ति। PCA घटक 1 मुख्य रूप से सतही वृद्धि तीव्रता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित और GA संकेत के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। PCA घटक 2 मुख्य रूप से सतही वृद्धि विषमता के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित और CLV3 अभिव्यक्ति के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। प्रतिशत प्रत्येक घटक द्वारा समझाई गई भिन्नता को दर्शाते हैं। d CZ को छोड़कर ऊतक पैमाने पर GA संकेत, सतही वृद्धि तीव्रता और सतही वृद्धि विषमता के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण। दाईं ओर की संख्या दो चरों के बीच स्पीयरमैन रो मान है। तारांकन उन मामलों को इंगित करते हैं जहां सहसंबंध/नकारात्मक सहसंबंध अत्यधिक महत्वपूर्ण है। e कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा Col-0 SAM L1 कोशिकाओं का 3D दृश्य। 10 घंटे पर SAM (लेकिन प्रिमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका भित्तियों को उनके कोण मानों के अनुसार रंग दिया गया है। रंग पट्टी निचले दाएँ कोने में दिखाई गई है। इनसेट 0 घंटे पर संबंधित 3D छवि दिखाता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। f बॉक्स प्लॉट IPR और गैर-IPR Col-0 SAM (n = 10 स्वतंत्र पौधों) में कोशिका विभाजन दर प्रदर्शित करते हैं। केंद्र रेखा माध्यिका दर्शाती है, और बॉक्स की सीमाएँ 25वें और 75वें प्रतिशतक को दर्शाती हैं। मूंछें R सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित न्यूनतम और अधिकतम मानों को दर्शाती हैं। P मान वेल्च के दो-पुच्छीय t-परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। g, h योजनाबद्ध आरेख दिखा रहा है (g) SAM (सफेद बिंदीदार रेखा) के केंद्र से रेडियल दिशा के संबंध में नई कोशिका भित्ति (मैजेंटा) के कोण को कैसे मापें (केवल न्यून कोण मान, यानी, 0-90 °, पर विचार किया जाता है), और (h) मेरिस्टेम के भीतर परिधीय / पार्श्व और रेडियल दिशाएं। i क्रमशः SAM (गहरा नीला), IPR (मध्यम नीला), और गैर-IPR (हल्का नीला) में कोशिका विभाजन विमान अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम। P मान ​​दो-पूंछ वाले कोलमोगोरोव-स्मिर्नोव परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था। j क्रमशः P3 (हल्का हरा), P4 (मध्यम हरा), और P5 (गहरा हरा) के आसपास IPR के कोशिका विभाजन विमान अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम।
इसलिए, हमने आगे परीक्षण के दौरान नवनिर्मित कोशिका भित्तियों की पहचान करके GA संकेतन और कोशिका विभाजन गतिविधि के बीच संबंध की जाँच की (चित्र 5e)। इस दृष्टिकोण से हमें कोशिका विभाजन की आवृत्ति और दिशा मापने में मदद मिली। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि IPR और शेष SAM (गैर-IPR, चित्र 5f) में कोशिका विभाजन की आवृत्ति समान थी, जो दर्शाता है कि IPR और गैर-IPR कोशिकाओं के बीच GA संकेतन में अंतर कोशिका विभाजन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। इसने, और GA संकेतन और वृद्धि विषमता के बीच सकारात्मक संबंध ने, हमें यह विचार करने के लिए प्रेरित किया कि क्या GA संकेतन गतिविधि कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित कर सकती है। हमने नई कोशिका भित्ति के अभिविन्यास को मेरिस्टेम केंद्र और नई कोशिका भित्ति के केंद्र को जोड़ने वाले रेडियल अक्ष के सापेक्ष एक न्यून कोण पर मापा (चित्र 5e-i) और रेडियल अक्ष के सापेक्ष लगभग 90° के कोणों पर कोशिकाओं के विभाजन की एक स्पष्ट प्रवृत्ति देखी, जिसकी उच्चतम आवृत्तियाँ 70-80° (23.28%) और 80-90° (22.62%) पर देखी गईं (चित्र 5e,i), जो परिधीय/अनुप्रस्थ दिशा में कोशिका विभाजन के अनुरूप हैं (चित्र 5h)। इस कोशिका विभाजन व्यवहार में GA संकेतन के योगदान की जाँच करने के लिए, हमने IPR और गैर-IPR में कोशिका विभाजन मापदंडों का अलग-अलग विश्लेषण किया (चित्र 5i)। हमने देखा कि आईपीआर कोशिकाओं में विभाजन कोण वितरण गैर-आईपीआर कोशिकाओं या पूरे एसएएम में कोशिकाओं से भिन्न था, आईपीआर कोशिकाओं ने पार्श्व/वृत्ताकार कोशिका विभाजन का उच्च अनुपात प्रदर्शित किया, यानी, 70-80 डिग्री और 80-90 डिग्री (क्रमशः 33.86% और 30.71%, इसी अनुपात) (चित्र 5i)। इस प्रकार, हमारी टिप्पणियों ने उच्च जीए सिग्नलिंग और परिधीय दिशा के करीब एक सेल विभाजन विमान अभिविन्यास के बीच संबंध का खुलासा किया, जो जीए सिग्नलिंग गतिविधि और विकास अनिसोट्रॉपी (चित्र 5 सी, डी) के बीच संबंध के समान है। इस संबंध के स्थानिक संरक्षण को और स्थापित करने के लिए, हमने पी 3 से शुरू होने वाले प्राइमोर्डियम के आसपास आईपीआर कोशिकाओं में विभाजन विमान अभिविन्यास को मापा, P3 और P4 के आसपास IPR के विभाजन कोणों में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा, हालाँकि P4 के आसपास IPR में पार्श्व कोशिका विभाजन की आवृत्ति में वृद्धि देखी गई (चित्र 5j)। हालाँकि, P5 के आसपास IPR कोशिकाओं में, कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो गया, साथ ही अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति में भी तीव्र वृद्धि हुई (चित्र 5j)। कुल मिलाकर, ये परिणाम बताते हैं कि GA संकेतन SAM में कोशिका विभाजन के अभिविन्यास को नियंत्रित कर सकता है, जो पिछली रिपोर्टों40,41 के अनुरूप है कि उच्च GA संकेतन IPR में कोशिका विभाजन के पार्श्व अभिविन्यास को प्रेरित कर सकता है।
यह अनुमान लगाया गया है कि IPR में कोशिकाएँ प्राइमोर्डिया में नहीं, बल्कि इंटरनोड्स में समाहित होंगी2,42,43। IPR में कोशिका विभाजनों के अनुप्रस्थ अभिविन्यास के परिणामस्वरूप इंटरनोड्स में एपिडर्मल कोशिकाओं की समानांतर अनुदैर्ध्य पंक्तियों का विशिष्ट संगठन हो सकता है। ऊपर वर्णित हमारे अवलोकनों से पता चलता है कि GA सिग्नलिंग कोशिका विभाजन की दिशा को नियंत्रित करके इस प्रक्रिया में भूमिका निभाता है।
कई DELLA जीनों की कार्यक्षमता में कमी के परिणामस्वरूप एक संरचनात्मक GA प्रतिक्रिया होती है, और इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए डेला म्यूटेंट का उपयोग किया जा सकता है44। हमने सबसे पहले SAM में पाँच DELLA जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया। GUS रेखा45 के प्रतिलेखन संलयन से पता चला कि GAI, RGA, RGL1, और RGL2 (काफी कम सीमा तक) SAM में अभिव्यक्त हुए (पूरक चित्र 11a-d)। इन-सीटू संकरण ने आगे प्रदर्शित किया कि GAI mRNA विशेष रूप से प्राइमोर्डिया और विकासशील पुष्पों में संचित होता है (पूरक चित्र 11e)। RGL1 और RGL3 mRNA पूरे SAM कैनोपी और पुराने पुष्पों में पाए गए, जबकि RGL2 mRNA सीमा क्षेत्र में अधिक प्रचुर मात्रा में था (पूरक चित्र 11f-h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM की कॉन्फोकल इमेजिंग ने इन-सीटू संकरण द्वारा देखी गई अभिव्यक्ति की पुष्टि की और दिखाया कि RGL3 प्रोटीन SAM के मध्य भाग में संचित होता है (पूरक चित्र 11i)। pRGA::GFP-RGA रेखा का उपयोग करते हुए, हमने यह भी पाया कि RGA प्रोटीन SAM में संचित होता है, लेकिन P4 से शुरू होने वाली सीमा पर इसकी प्रचुरता कम हो जाती है (पूरक चित्र 11j)। उल्लेखनीय रूप से, RGL3 और RGA के अभिव्यक्ति पैटर्न IPR में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि के अनुरूप हैं, जैसा कि qmRGA द्वारा पता लगाया गया है (चित्र 4)। इसके अलावा, ये आँकड़े दर्शाते हैं कि सभी DELLA SAM में अभिव्यक्त होते हैं और उनकी अभिव्यक्ति सामूहिक रूप से पूरे SAM में फैली होती है।
इसके बाद हमने वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियंत्रण) और gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 डेला क्विंटुपल (वैश्विक) म्यूटेंट (चित्र 6a, b) में कोशिका विभाजन मापदंडों का विश्लेषण किया। दिलचस्प बात यह है कि हमने वाइल्ड टाइप (चित्र 6c) की तुलना में डेला ग्लोबल म्यूटेंट SAM में कोशिका विभाजन कोण आवृत्तियों के वितरण में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बदलाव देखा। डेला ग्लोबल म्यूटेंट में यह परिवर्तन 80-90° कोणों (34.71% बनाम 24.55%) की आवृत्ति में वृद्धि और, कुछ हद तक, 70-80° कोणों (23.78% बनाम 20.18%), यानी अनुप्रस्थ कोशिका विभाजनों के अनुरूप वृद्धि के कारण हुआ (चित्र 6c)। डेला ग्लोबल म्यूटेंट (चित्र 6c) में गैर-अनुप्रस्थ विभाजनों (0-60°) की आवृत्ति भी कम थी। डेला ग्लोबल म्यूटेंट के SAM में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति उल्लेखनीय रूप से बढ़ी हुई थी (चित्र 6b)। IPR में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति भी वाइल्ड टाइप की तुलना में डेला ग्लोबल म्यूटेंट में अधिक थी (चित्र 6d)। IPR क्षेत्र के बाहर, वाइल्ड टाइप में कोशिका विभाजन कोणों का वितरण अधिक समान था, जबकि डेला ग्लोबल म्यूटेंट ने IPR की तरह स्पर्शरेखीय विभाजनों को प्राथमिकता दी (चित्र 6e)। हमने ga2 ऑक्सीडेज (ga2ox) पंचगुण म्यूटेंट (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, और ga2ox6-2) के SAM में कोशिका विभाजन की दिशा का भी परिमाणन किया, जो एक GA-निष्क्रिय म्यूटेंट पृष्ठभूमि है जिसमें GA संचित होता है। GA स्तरों में वृद्धि के अनुरूप, पंचगुना ga2ox उत्परिवर्ती पुष्पक्रम का SAM, Col-0 (पूरक चित्र 12a, b) से बड़ा था, और Col-0 की तुलना में, पंचगुना ga2ox SAM ने कोशिका विभाजन कोणों का एक स्पष्ट रूप से भिन्न वितरण दर्शाया, जिसमें कोण आवृत्ति 50° से 90° तक बढ़ गई, अर्थात फिर से स्पर्शरेखीय विभाजनों को बढ़ावा मिला (पूरक चित्र 12a-c)। इस प्रकार, हम दर्शाते हैं कि GA संकेतन और GA संचयन की संरचनात्मक सक्रियता, IPR और शेष SAM में पार्श्व कोशिका विभाजन को प्रेरित करती है।
ए, बी पीआई-रंजित लेर (ए) और ग्लोबल डेला म्यूटेंट (बी) एसएएम की एल 1 परत का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहा है। 10 घंटे की अवधि में एसएएम (लेकिन प्रिमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका भित्ति को उनके कोण मूल्यों के अनुसार दिखाया और रंग दिया गया है। इनसेट 0 घंटे पर एसएएम दिखाता है। रंग बार निचले दाएं कोने में प्रदर्शित होता है। (बी) में तीर ग्लोबल डेला म्यूटेंट में संरेखित सेल फ़ाइलों के एक उदाहरण को इंगित करता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था। पूरे एसएएम (डी), आईपीआर (ई), और गैर-आईपीआर (एफ) में लेर और ग्लोबल डेला के बीच सेल डिवीजन प्लेन अभिविन्यास के आवृत्ति वितरण की सीई तुलना f, g Col-0 (i) और pCUC2::gai-1-VENUS (j) ट्रांसजेनिक पौधों के PI-रंजित SAM की कॉन्फोकल छवियों का 3D विज़ुअलाइज़ेशन। पैनल (a, b) 10 घंटे के भीतर SAM में बनी नई कोशिका भित्ति (लेकिन प्राइमोर्डिया नहीं) दिखाते हैं। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। h–j Col-0 और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के बीच संपूर्ण SAM (h), IPR (i) और गैर-IPR (j) में स्थित कोशिका विभाजन समतल अभिविन्यासों के आवृत्ति वितरण की तुलना। P मान दो-पुच्छीय कोल्मोगोरोव-स्मिर्नोव परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।
इसके बाद हमने विशेष रूप से IPR में GA संकेतन के अवरोधन के प्रभाव का परीक्षण किया। इसके लिए, हमने VENUS (pCUC2::gai-1-VENUS वंश में) से जुड़े एक प्रमुख ऋणात्मक gai-1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए बीजपत्र कप 2 (CUC2) प्रमोटर का उपयोग किया। वन्य-प्रकार SAM में, CUC2 प्रमोटर, P4 से आगे SAM में, सीमांत कोशिकाओं सहित, अधिकांश IPRs की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में भी इसी प्रकार की विशिष्ट अभिव्यक्ति देखी गई (नीचे देखें)। pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के SAM या IPR में कोशिका विभाजन कोणों का वितरण वन्य-प्रकार से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था, हालाँकि अप्रत्याशित रूप से हमने पाया कि इन पौधों में बिना IPR वाली कोशिकाएँ 80-90° की उच्च आवृत्ति पर विभाजित होती हैं (चित्र 6f-j)।
यह सुझाव दिया गया है कि कोशिका विभाजन की दिशा SAM की ज्यामिति पर निर्भर करती है, विशेष रूप से ऊतक वक्रता द्वारा उत्पन्न तन्यता प्रतिबल पर46। इसलिए हमने पूछा कि क्या डेला ग्लोबल म्यूटेंट और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में SAM का आकार परिवर्तित हुआ था। जैसा कि पहले बताया गया था12, डेला ग्लोबल म्यूटेंट SAM का आकार वाइल्ड टाइप (पूरक चित्र 13a, b, d) से बड़ा था। CLV3 और STM RNA के इन-सीटू संकरण ने डेला म्यूटेंट में मेरिस्टेम विस्तार की पुष्टि की और स्टेम सेल निचे के पार्श्व विस्तार को भी दर्शाया (पूरक चित्र 13e, f, h, i)। हालाँकि, SAM वक्रता दोनों जीनोटाइप में समान थी (पूरक चित्र 13k, m, n, p)। हमने gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में जंगली प्रकार की तुलना में वक्रता में परिवर्तन के बिना आकार में समान वृद्धि देखी (पूरक चित्र 13c, d, g, j, l, o, p)। डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में कोशिका विभाजन अभिविन्यास की आवृत्ति भी प्रभावित हुई, लेकिन डेला मोनोलिथिक म्यूटेंट की तुलना में कम हद तक (पूरक चित्र 12d-f)। यह खुराक प्रभाव, वक्रता पर प्रभाव की कमी के साथ, यह दर्शाता है कि डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में अवशिष्ट RGL3 गतिविधि, DELLA गतिविधि के नुकसान के कारण कोशिका विभाजन अभिविन्यास में होने वाले परिवर्तनों को सीमित करती है और पार्श्व कोशिका विभाजन में परिवर्तन SAM ज्यामिति में परिवर्तन के बजाय GA सिग्नलिंग गतिविधि में परिवर्तन की प्रतिक्रिया में होते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, CUC2 प्रमोटर P4 से शुरू होकर SAM में IPR अभिव्यक्ति को संचालित करता है (पूरक चित्र 14a, b), और इसके विपरीत, pCUC2::gai-1-VENUS SAM का आकार छोटा लेकिन वक्रता अधिक थी (पूरक चित्र 14c–h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारिकी में यह परिवर्तन, वाइल्ड टाइप की तुलना में यांत्रिक तनावों के एक भिन्न वितरण का परिणाम हो सकता है, जिसमें उच्च परिधीय तनाव SAM केंद्र47 से कम दूरी पर शुरू होते हैं। वैकल्पिक रूप से, pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारिकी में परिवर्तन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति48 द्वारा प्रेरित क्षेत्रीय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकते हैं। दोनों ही मामलों में, यह कोशिकाओं के परिधीय/अनुप्रस्थ अभिविन्यास में विभाजित होने की संभावना को बढ़ाकर GA संकेतन में परिवर्तनों के प्रभावों को आंशिक रूप से संतुलित कर सकता है, जो हमारे अवलोकनों को स्पष्ट करता है।
कुल मिलाकर, हमारे आँकड़े इस बात की पुष्टि करते हैं कि उच्च GA सिग्नलिंग IPR में कोशिका विभाजन तल के पार्श्व अभिविन्यास में सक्रिय भूमिका निभाता है। वे यह भी दर्शाते हैं कि मेरिस्टेम वक्रता भी IPR में कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित करती है।
उच्च GA संकेतन गतिविधि के कारण, IPR में विभाजन तल का अनुप्रस्थ अभिविन्यास यह दर्शाता है कि GA, SAM के भीतर एपिडर्मिस में एक रेडियल कोशिका फ़ाइल को पूर्व-व्यवस्थित करता है ताकि कोशिकीय संगठन को परिभाषित किया जा सके जो बाद में एपिडर्मल इंटरनोड में पाया जाएगा। वास्तव में, डेला ग्लोबल म्यूटेंट्स (चित्र 6b) की SAM छवियों में ऐसी कोशिका फ़ाइलें अक्सर दिखाई देती थीं। इस प्रकार, SAM में GA संकेतन के स्थानिक पैटर्न के विकासात्मक कार्य का और अधिक अन्वेषण करने के लिए, हमने वाइल्ड-टाइप (Ler और Col-0), डेला ग्लोबल म्यूटेंट्स, और pCUC2::gai-1-VENUS ट्रांसजेनिक पौधों में IPR में कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग किया।
हमने पाया कि qmRGA ने दिखाया कि IPR में GA सिग्नलिंग गतिविधि P1/P2 से बढ़ी और P4 पर चरम पर पहुंच गई, और यह पैटर्न समय के साथ स्थिर रहा (चित्र 4a-f और अनुपूरक चित्र 8c-f, k)। बढ़ते GA सिग्नल के साथ IPR में कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए, हमने पहले अवलोकन के 34 घंटे बाद विश्लेषित उनके विकासात्मक भाग्य के अनुसार P4 के ऊपर और किनारों पर Ler IPR कोशिकाओं को लेबल किया, यानी, दो से अधिक प्लास्टिड समय, जिससे हमें P1/P2 से P4 तक प्राइमोर्डियम विकास के दौरान IPR कोशिकाओं का अनुसरण करने की अनुमति मिली। हमने तीन अलग-अलग रंगों का इस्तेमाल किया: उन कोशिकाओं के लिए पीला जो P4 के पास प्राइमोर्डियम में एकीकृत थीं, उनके लिए हरा जो IPR में थीं, और बैंगनी उनके लिए जो दोनों प्रक्रियाओं में शामिल थीं (चित्र 7a-c)। जैसा कि अपेक्षित था, जब ये कोशिकाएँ विभाजित हुईं, तो उन्होंने ऐसा मुख्यतः अनुप्रस्थ विभाजन तल (चित्र 7a-c) के माध्यम से किया। Col-0 SAM (P3 पर केंद्रित, जिसकी सीमा Ler में P4 के समान ही मुड़ी हुई है) का उपयोग करके भी इसी तरह के परिणाम प्राप्त हुए, हालाँकि इस जीनोटाइप में पुष्प सीमा पर बनी तह ने IPR कोशिकाओं को अधिक तेज़ी से छिपा दिया (चित्र 7g-i)। इस प्रकार, IPR कोशिकाओं का विभाजन पैटर्न कोशिकाओं को अरीय पंक्तियों में पूर्व-व्यवस्थित करता है, जैसा कि इंटरनोड्स में होता है। अरीय पंक्तियों का संगठन और क्रमिक अंगों के बीच IPR कोशिकाओं का स्थानीकरण यह दर्शाता है कि ये कोशिकाएँ इंटरनोडल पूर्वज हैं।
यहाँ, हमने एक अनुपातमितीय GA सिग्नलिंग बायोसेंसर, qmRGA, विकसित किया है जो अंतर्जात सिग्नलिंग मार्गों में हस्तक्षेप को न्यूनतम करते हुए, GA और GA रिसेप्टर सांद्रता के संयोजन से उत्पन्न GA सिग्नलिंग गतिविधि का मात्रात्मक मानचित्रण करने की अनुमति देता है, जिससे कोशिकीय स्तर पर GA के कार्य के बारे में जानकारी मिलती है। इस उद्देश्य से, हमने एक संशोधित DELLA प्रोटीन, mRGA, का निर्माण किया है, जिसने DELLA अंतःक्रिया भागीदारों को बांधने की क्षमता खो दी है, लेकिन GA-प्रेरित प्रोटियोलिसिस के प्रति संवेदनशील बना हुआ है। qmRGA, GA स्तरों में बहिर्जात और अंतर्जात दोनों परिवर्तनों के प्रति प्रतिक्रिया करता है, और इसके गतिशील संवेदन गुण विकास के दौरान GA सिग्नलिंग गतिविधि में स्थानिक-कालिक परिवर्तनों का आकलन करने में सक्षम बनाते हैं। qmRGA एक बहुत ही लचीला उपकरण भी है क्योंकि इसे इसके अभिव्यक्ति के लिए प्रयुक्त प्रमोटर (यदि आवश्यक हो) को बदलकर विभिन्न ऊतकों के अनुकूल बनाया जा सकता है, और GA सिग्नलिंग मार्ग की संरक्षित प्रकृति और एंजियोस्पर्मों में PFYRE रूपांकन को देखते हुए, यह अन्य प्रजातियों में स्थानांतरित होने की संभावना है22। इसके अनुरूप, चावल के SLR1 DELLA प्रोटीन (HYY497AAA) में एक समतुल्य उत्परिवर्तन भी SLR1 की वृद्धि दमनकारी गतिविधि को दबाता हुआ दिखाया गया है, जबकि mRGA23 के समान, इसके GA-मध्यस्थ क्षरण को केवल थोड़ा कम करता है। उल्लेखनीय रूप से, अरेबिडोप्सिस में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PFYRE डोमेन (S474L) में एक एकल अमीनो एसिड उत्परिवर्तन ने RGA की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बदल दिया, बिना इसके ट्रांसक्रिप्शन कारक भागीदारों के साथ अंतःक्रिया करने की क्षमता को प्रभावित किए। हालांकि यह उत्परिवर्तन mRGA में मौजूद 3 अमीनो एसिड प्रतिस्थापनों के बहुत करीब है, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि ये दोनों उत्परिवर्तन DELLA की विशिष्ट विशेषताओं को बदल देते हैं। हालांकि अधिकांश ट्रांसक्रिप्शन कारक भागीदार DELLA26,51 के LHR1 और SAW डोमेन से बंधते हैं
इंटरनोड विकास पादप संरचना और उपज सुधार में एक प्रमुख विशेषता है। qmRGA ने IPR इंटरनोड पूर्वज कोशिकाओं में उच्च GA संकेतन गतिविधि का खुलासा किया। मात्रात्मक इमेजिंग और आनुवंशिकी के संयोजन से, हमने दिखाया कि GA संकेतन पैटर्न SAM एपिडर्मिस में वृत्ताकार/अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन तलों पर अध्यारोपित होते हैं, जिससे इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक कोशिका विभाजन संगठन का निर्माण होता है। विकास के दौरान कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के कई नियामकों की पहचान की गई है52,53। हमारा कार्य इस बात का एक स्पष्ट उदाहरण प्रदान करता है कि GA संकेतन गतिविधि इस कोशिकीय पैरामीटर को कैसे नियंत्रित करती है। DELLA प्रीफोल्डिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स41 के साथ परस्पर क्रिया कर सकता है, इसलिए GA संकेतन कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास40,41,54,55 को सीधे प्रभावित करके कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास को नियंत्रित कर सकता है। हमने अप्रत्याशित रूप से दिखाया कि SAM में, उच्च GA संकेतन गतिविधि का सहसंबंध कोशिका वृद्धि या विभाजन नहीं था, बल्कि केवल वृद्धि विषमता थी, जो IPR में कोशिका विभाजन की दिशा पर GA के प्रत्यक्ष प्रभाव के अनुरूप है। हालाँकि, हम इस बात से इंकार नहीं कर सकते कि यह प्रभाव अप्रत्यक्ष भी हो सकता है, उदाहरण के लिए GA-प्रेरित कोशिका भित्ति मृदुकरण56 द्वारा मध्यस्थता। कोशिका भित्ति गुणों में परिवर्तन यांत्रिक तनाव57,58 उत्पन्न करते हैं, जो कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं39,46,59 के अभिविन्यास को प्रभावित करके कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को भी प्रभावित कर सकता है। GA-प्रेरित यांत्रिक तनाव और GA द्वारा सूक्ष्मनलिका अभिविन्यास के प्रत्यक्ष नियमन के संयुक्त प्रभाव, इंटरनोड्स को परिभाषित करने के लिए IPR में कोशिका विभाजन अभिविन्यास के एक विशिष्ट पैटर्न को उत्पन्न करने में शामिल हो सकते हैं, और इस विचार का परीक्षण करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है। इसी प्रकार, पिछले अध्ययनों ने इंटरनोड निर्माण60,61 के नियंत्रण में DELLA-अंतःक्रियाशील प्रोटीन TCP14 और 15 के महत्व पर प्रकाश डाला है और ये कारक ब्रेविपेडिसेलस (BP) और पेनीवाइज (PNY) के साथ मिलकर GA की क्रिया की मध्यस्थता कर सकते हैं, जो इंटरनोड विकास को नियंत्रित करते हैं और GA सिग्नलिंग2,62 को प्रभावित करते पाए गए हैं। यह देखते हुए कि DELLAs ब्रैसिनोस्टेरॉइड, एथिलीन, जैस्मोनिक एसिड और एब्सिसिक एसिड (ABA) सिग्नलिंग मार्गों63,64 के साथ परस्पर क्रिया करते हैं और ये हार्मोन माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास65 को प्रभावित कर सकते हैं, कोशिका विभाजन अभिविन्यास पर GA के प्रभाव अन्य हार्मोनों द्वारा भी मध्यस्थ हो सकते हैं।
प्रारंभिक कोशिका विज्ञान संबंधी अध्ययनों से पता चला है कि एराबिडोप्सिस एसएएम के आंतरिक और बाहरी दोनों क्षेत्र इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक हैं2,42। यह तथ्य कि GA आंतरिक ऊतकों में कोशिका विभाजन को सक्रिय रूप से नियंत्रित करता है12, SAM में विभज्योतक और इंटरनोड आकार को नियंत्रित करने में GA के दोहरे कार्य का समर्थन करता है। आंतरिक एसएएम ऊतक में दिशात्मक कोशिका विभाजन का पैटर्न भी कड़ाई से नियंत्रित होता है, और यह नियमन स्टेम वृद्धि52 के लिए आवश्यक है। यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या GA आंतरिक एसएएम संगठन में कोशिका विभाजन तल को उन्मुख करने में भी भूमिका निभाता है, जिससे एसएएम के भीतर इंटरनोड्स के विनिर्देशन और विकास में समन्वय स्थापित होता है।
पौधों को मिट्टी या 1x मुराशिगे-स्कोग (एमएस) माध्यम (डूचेफा) में मानक परिस्थितियों (16 घंटे प्रकाश, 22°C) में 1% सुक्रोज और 1% अगर (सिग्मा) के साथ इन विट्रो में उगाया गया, सिवाय हाइपोकोटाइल और जड़ वृद्धि प्रयोगों के जिनमें पौधों को निरंतर प्रकाश और 22°C के तापमान पर ऊर्ध्वाधर प्लेटों पर उगाया गया था। नाइट्रेट प्रयोगों के लिए, पौधों को संशोधित एमएस माध्यम (बायोवर्ल्ड पादप माध्यम) में पर्याप्त नाइट्रेट (0 या 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-सक्सीनेट, 1% सुक्रोज और 1% A-अगर (सिग्मा) के साथ लंबे दिन की परिस्थितियों में उगाया गया।
pDONR221 में प्रविष्ट GID1a cDNA को pDONR P4-P1R-pUBQ10 और pDONR P2R-P3-mCherry के साथ pB7m34GW में पुनर्संयोजित करके pUBQ10::GID1a-mCherry उत्पन्न किया गया। pDONR221 में प्रविष्ट IDD2 DNA को pB7RWG266 में पुनर्संयोजित करके p35S:IDD2-RFP उत्पन्न किया गया। pGID1b::2xmTQ2-GID1b उत्पन्न करने के लिए, GID1b कोडिंग क्षेत्र के अपस्ट्रीम में 3.9 kb का एक टुकड़ा और GID1b cDNA (1.3 kb) और टर्मिनेटर (3.4 kb) युक्त 4.7 kb का एक टुकड़ा पहले पूरक तालिका 3 में प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया और फिर क्रमशः pDONR P4-P1R (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और pDONR P2R-P3 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में डाला गया, और अंत में गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करके pGreen 012567 लक्ष्य वेक्टर में pDONR221 2xmTQ268 के साथ पुनर्संयोजित किया गया। pCUC2::LSSmOrange उत्पन्न करने के लिए, CUC2 प्रमोटर अनुक्रम (ATG से 3229 bp अपस्ट्रीम) के बाद बड़े स्टोक्स-शिफ्टेड mOrange (LSSmOrange)69 के कोडिंग अनुक्रम को N7 न्यूक्लियर लोकलाइज़ेशन सिग्नल और NOS ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेटर के साथ गेटवे 3-खंड पुनर्संयोजन प्रणाली (इंविट्रोजन) का उपयोग करके pGreen कैनामाइसिन टार्गेटिंग वेक्टर में संयोजित किया गया। पादप बाइनरी वेक्टर को क्रमशः एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैसिएन्स स्ट्रेन GV3101 में प्रविष्ट कराया गया और निकोटियाना बेंथमियाना पत्तियों में एग्रोबैक्टीरियम इन्फिल्ट्रेशन विधि द्वारा और एराबिडोप्सिस थालियाना Col-0 में पुष्प डिप विधि द्वारा प्रविष्ट कराया गया। pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry और pCLV3::mCherry-NLS qmRGA को क्रमशः संबंधित क्रॉस की F3 और F1 संततियों से पृथक किया गया।
लगभग 1 सेमी लंबे प्ररोह शीर्षों72 पर आरएनए इन-सीटू संकरण किया गया, जिन्हें एकत्रित करके तुरंत 4°C तक पूर्व-शीतित FAA विलयन (3.7% फॉर्मेल्डिहाइड, 5% एसिटिक अम्ल, 50% इथेनॉल) में स्थिर किया गया। 2 × 15 मिनट के निर्वात उपचार के बाद, स्थिरक को बदल दिया गया और नमूनों को रात भर इनक्यूबेट किया गया। पूरक तालिका 3 में दिखाए गए प्राइमरों का उपयोग करके GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, और RGL3 cDNA और उनके 3′-UTRs के प्रति-संवेदी जांचों को संश्लेषित किया गया, जैसा कि रोसियर एट अल.73 द्वारा वर्णित है। डिगोक्सीजेनिन-लेबल जांच को डिगोक्सीजेनिन एंटीबॉडी (3000 गुना कमजोर पड़ने; रोश, कैटलॉग संख्या: 11 093 274 910) का उपयोग करके प्रतिरक्षा का पता लगाया गया था, और वर्गों को 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी, 250 गुना कमजोर पड़ने) / नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी, 200 गुना कमजोर पड़ने) समाधान के साथ दाग दिया गया था।