मात्रात्मक जिबरेलिन बायोसेंसर ने शूट एपिकल मेरिस्टेम में इंटरनोड विनिर्देशन में जिबरेलिन की भूमिका का खुलासा किया

तने की संरचना के लिए शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) की वृद्धि महत्वपूर्ण है। पादप हार्मोनजिबरेलिन(GAs) पौधों की वृद्धि के समन्वय में मुख्य भूमिका निभाते हैं, लेकिन SAM में उनकी भूमिका को अभी भी ठीक से समझा नहीं गया है। यहाँ, हमने GA पहचान पर इसके क्षरण को संरक्षित करते हुए GA ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया में इसके आवश्यक विनियामक कार्य को दबाने के लिए DELLA प्रोटीन की इंजीनियरिंग करके GA सिग्नलिंग का एक अनुपातमितीय बायोसेंसर विकसित किया है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह क्षरण-आधारित बायोसेंसर विकास के दौरान GA स्तरों और सेलुलर सेंसिंग में परिवर्तनों को सटीक रूप से रिकॉर्ड करता है। हमने SAM में GA सिग्नलिंग गतिविधि को मैप करने के लिए इस बायोसेंसर का उपयोग किया। हम दिखाते हैं कि उच्च GA संकेत मुख्य रूप से अंग प्राइमोर्डिया के बीच स्थित कोशिकाओं में मौजूद होते हैं, जो इंटरनोड कोशिकाओं के अग्रदूत होते हैं। लाभ- और हानि-कार्य दृष्टिकोणों का उपयोग करते हुए, हम आगे प्रदर्शित करते हैं कि GA कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है, इंटरनोड्स के विहित सेलुलर संगठन की स्थापना करता है, जिससे SAM में इंटरनोड विनिर्देशन को बढ़ावा मिलता है।
शूट एपेक्स पर स्थित शूट एपिकल मेरिस्टेम (SAM) में स्टेम कोशिकाओं का एक आला होता है, जिसकी गतिविधि पौधे के पूरे जीवन में मॉड्यूलर और पुनरावृत्त तरीके से पार्श्व अंगों और स्टेम नोड्स को उत्पन्न करती है। इनमें से प्रत्येक दोहराई जाने वाली इकाई, या प्लांट नोड्स में नोड्स पर इंटरनोड्स और पार्श्व अंग, और पत्ती की धुरी में अक्षीय मेरिस्टेम शामिल होते हैं1। विकास के दौरान पौधे के नोड्स की वृद्धि और संगठन में परिवर्तन होता है। अरेबिडोप्सिस में, वनस्पति अवस्था के दौरान इंटरनोडल वृद्धि को दबा दिया जाता है, और एक्सिलरी मेरिस्टेम रोसेट पत्तियों के अक्ष में निष्क्रिय रहते हैं। पुष्प अवस्था में संक्रमण के दौरान, SAM पुष्पक्रम मेरिस्टेम बन जाता है, जो लम्बी इंटरनोड्स और अक्षीय कलियों, फूलगोभी के पत्तों के अक्ष में शाखाएँ और बाद में, पत्ती रहित फूल2 उत्पन्न करता है। हालाँकि हमने पत्तियों, फूलों और शाखाओं की शुरुआत को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति की है, लेकिन इंटरनोड्स कैसे उत्पन्न होते हैं, इसके बारे में अपेक्षाकृत कम जानकारी है।
GAs के स्थानिक वितरण को समझने से विभिन्न ऊतकों और विभिन्न विकासात्मक चरणों में इन हार्मोनों के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। अपने स्वयं के प्रमोटर की कार्रवाई के तहत व्यक्त RGA-GFP संलयन के क्षरण का दृश्य जड़ों में कुल GA स्तरों के विनियमन पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है15,16। हालांकि, RGA अभिव्यक्ति ऊतकों में भिन्न होती है17 और GA18 द्वारा विनियमित होती है। इस प्रकार, RGA प्रमोटर की भिन्न अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप RGA-GFP के साथ देखे गए प्रतिदीप्ति पैटर्न हो सकते हैं और इस प्रकार यह विधि मात्रात्मक नहीं है। हाल ही में, बायोएक्टिव फ्लोरेसिन (Fl)-लेबल वाले GA19,20 ने जड़ के एंडोकॉर्टेक्स में GA के संचय और GA परिवहन द्वारा इसके सेलुलर स्तरों के विनियमन का खुलासा किया। हाल ही में, GA FRET सेंसर nlsGPS1 ने दिखाया कि GA का स्तर जड़ों, तंतुओं और गहरे रंग के हाइपोकोटाइल्स21 में कोशिका वृद्धि के साथ सहसंबंधित है। हालाँकि, जैसा कि हमने देखा है, GA सांद्रता GA सिग्नलिंग गतिविधि को नियंत्रित करने वाला एकमात्र पैरामीटर नहीं है, क्योंकि यह जटिल संवेदन प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है। यहाँ, DELLA और GA सिग्नलिंग मार्गों की हमारी समझ के आधार पर, हम GA सिग्नलिंग के लिए गिरावट-आधारित अनुपातमितीय बायोसेंसर के विकास और लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं। इस मात्रात्मक बायोसेंसर को विकसित करने के लिए, हमने एक उत्परिवर्ती GA-संवेदनशील RGA का उपयोग किया जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़ा हुआ था और ऊतकों में सर्वत्र व्यक्त किया गया था, साथ ही एक GA-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी। हम दिखाते हैं कि उत्परिवर्ती RGA प्रोटीन संलयन सर्वत्र व्यक्त होने पर अंतर्जात GA सिग्नलिंग में हस्तक्षेप नहीं करते हैं, और यह बायोसेंसर उच्च स्थानिक संकल्प के साथ संवेदन तंत्र द्वारा GA इनपुट और GA सिग्नल प्रोसेसिंग दोनों से उत्पन्न सिग्नलिंग गतिविधि को मात्रात्मक रूप से निर्धारित कर सकता है। हमने इस बायोसेंसर का उपयोग GA सिग्नलिंग गतिविधि के स्थानिक वितरण को मैप करने और यह निर्धारित करने के लिए किया कि GA SAM एपिडर्मिस में सेलुलर व्यवहार को कैसे नियंत्रित करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि GA ऑर्गन प्राइमोर्डिया के बीच स्थित SAM कोशिकाओं के विभाजन तल के अभिविन्यास को नियंत्रित करता है, जिससे इंटरनोड के विहित सेलुलर संगठन को परिभाषित किया जाता है।
अंत में, हमने पूछा कि क्या qmRGA बढ़ते हाइपोकोटाइल का उपयोग करके अंतर्जात GA स्तरों में परिवर्तन की रिपोर्ट कर सकता है। हमने पहले दिखाया था कि नाइट्रेट GA संश्लेषण को बढ़ाकर वृद्धि को उत्तेजित करता है और बदले में, DELLA34 गिरावट को बढ़ाता है। तदनुसार, हमने देखा कि प्रचुर मात्रा में नाइट्रेट आपूर्ति (10 mM NO3−) के तहत उगाए गए pUBQ10::qmRGA पौधों में हाइपोकोटाइल की लंबाई नाइट्रेट की कमी वाली स्थितियों (पूरक चित्र 6a) के तहत उगाए गए पौधों की तुलना में काफी लंबी थी। वृद्धि प्रतिक्रिया के अनुरूप, 10 mM NO3− स्थितियों के तहत उगाए गए पौधों के हाइपोकोटाइल में GA संकेत नाइट्रेट की अनुपस्थिति में उगाए गए पौधों की तुलना में अधिक थे (पूरक चित्र 6b, c)। इस प्रकार, qmRGA GA सांद्रता में अंतर्जात परिवर्तनों द्वारा प्रेरित GA सिग्नलिंग में परिवर्तनों की निगरानी भी सक्षम बनाता है।
यह समझने के लिए कि क्या qmRGA द्वारा पता लगाई गई GA सिग्नलिंग गतिविधि GA सांद्रता और GA धारणा पर निर्भर करती है, जैसा कि सेंसर डिज़ाइन के आधार पर अपेक्षित था, हमने वनस्पति और प्रजनन ऊतकों में तीन GID1 रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। अंकुरों में, GID1-GUS रिपोर्टर लाइन ने दिखाया कि GID1a और c कोटिलेडोन (चित्र 3a-c) में अत्यधिक व्यक्त किया गया था। इसके अलावा, सभी तीन रिसेप्टर्स पत्तियों, पार्श्व रूट प्राइमोर्डिया, रूट टिप्स (GID1b की रूट कैप को छोड़कर) और संवहनी प्रणाली (चित्र 3a-c) में व्यक्त किए गए थे। पुष्पक्रम SAM में, हमने केवल GID1b और 1c (पूरक चित्र 7a-c) के लिए GUS संकेतों का पता लगाया। इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन ने इन अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि की और आगे प्रदर्शित किया कि GID1c SAM में कम स्तरों पर समान रूप से व्यक्त किया गया था, जबकि GID1b ने SAM की परिधि में उच्च अभिव्यक्ति दिखाई (पूरक चित्र 7d-l)। pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रांसलेशनल फ़्यूज़न ने GID1b अभिव्यक्ति की एक क्रमिक श्रेणी का भी खुलासा किया, SAM के केंद्र में कम या कोई अभिव्यक्ति नहीं से लेकर अंग सीमाओं पर उच्च अभिव्यक्ति तक (पूरक चित्र 7m)। इस प्रकार, GID1 रिसेप्टर्स ऊतकों में और भीतर समान रूप से वितरित नहीं होते हैं। बाद के प्रयोगों में, हमने यह भी देखा कि GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) की अधिक अभिव्यक्ति ने हाइपोकोटाइल में qmRGA की बाहरी GA अनुप्रयोग के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ा दिया (चित्र 3d, e)। इसके विपरीत, हाइपोकोटाइल में qd17mRGA द्वारा मापी गई प्रतिदीप्ति GA3 उपचार के प्रति असंवेदनशील थी (चित्र 3f, g)। दोनों परीक्षणों के लिए, सेंसर के तेज़ व्यवहार का आकलन करने के लिए पौधों को GA (100 μM GA3) की उच्च सांद्रता के साथ उपचारित किया गया, जहाँ GID1 रिसेप्टर से बंधने की क्षमता बढ़ गई या खो गई। कुल मिलाकर, ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि qmRGA बायोसेंसर GA और GA सेंसर के रूप में एक संयुक्त कार्य करता है, और सुझाव देता है कि GID1 रिसेप्टर की विभेदक अभिव्यक्ति सेंसर की उत्सर्जन क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से नियंत्रित कर सकती है।
आज तक, SAM में GA संकेतों का वितरण अस्पष्ट बना हुआ है। इसलिए, हमने qmRGA-व्यक्त करने वाले पौधों और pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 का उपयोग करके GA संकेत गतिविधि के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मात्रात्मक मानचित्रों की गणना की, L1 परत (एपिडर्मिस; चित्र 4a, b, विधियाँ और पूरक विधियाँ देखें) पर ध्यान केंद्रित किया, क्योंकि L1 SAM वृद्धि36 को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहाँ, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्ति ने GA संकेत गतिविधि37 के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक निश्चित ज्यामितीय संदर्भ बिंदु प्रदान किया। हालाँकि GA को पार्श्व अंग विकास4 के लिए आवश्यक माना जाता है, हमने देखा कि P3 चरण (चित्र 4a, b) से शुरू होने वाले पुष्प प्राइमोर्डियम (P) में GA संकेत कम थे, जबकि युवा P1 और P2 प्राइमोर्डियम में मध्य क्षेत्र (चित्र 4a, b) के समान मध्यम गतिविधि थी। अंग प्राइमोर्डियम सीमाओं पर उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का पता लगाया गया, जो P1/P2 (सीमा के किनारों पर) से शुरू होकर P4 पर चरम पर पहुंच गई, साथ ही प्राइमोर्डिया के बीच स्थित परिधीय क्षेत्र की सभी कोशिकाओं में (चित्र 4a, b और अनुपूरक चित्र 8a, b)। यह उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि न केवल एपिडर्मिस में बल्कि L2 और ऊपरी L3 परतों में भी देखी गई (अनुपूरक चित्र 8b)। qmRGA का उपयोग करके SAM में पता लगाए गए GA सिग्नल का पैटर्न भी समय के साथ अपरिवर्तित रहा (अनुपूरक चित्र 8c-f, k)। हालाँकि qd17mRGA निर्माण को पाँच स्वतंत्र लाइनों से T3 पौधों के SAM में व्यवस्थित रूप से कम किया गया था, जिन्हें हमने विस्तार से चित्रित किया था, हम pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP निर्माण (अनुपूरक चित्र 8g-j, l) के साथ प्राप्त प्रतिदीप्ति पैटर्न का विश्लेषण करने में सक्षम थे। इस नियंत्रण रेखा में, SAM में प्रतिदीप्ति अनुपात में केवल मामूली परिवर्तन पाए गए, लेकिन SAM केंद्र में हमने TagBFP से जुड़े VENUS में स्पष्ट और अप्रत्याशित कमी देखी। यह पुष्टि करता है कि qmRGA द्वारा देखा गया सिग्नलिंग पैटर्न mRGA-VENUS के GA-निर्भर क्षरण को दर्शाता है, लेकिन यह भी दर्शाता है कि qmRGA मेरिस्टेम केंद्र में GA सिग्नलिंग गतिविधि को अधिक आंक सकता है। संक्षेप में, हमारे परिणाम एक GA सिग्नलिंग पैटर्न को प्रकट करते हैं जो मुख्य रूप से प्राइमोर्डिया के वितरण को दर्शाता है। अंतर-प्राइमोर्डियल क्षेत्र (IPR) का यह वितरण विकासशील प्राइमोर्डियम और केंद्रीय क्षेत्र के बीच उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि की क्रमिक स्थापना के कारण है, जबकि उसी समय प्राइमोर्डियम में GA सिग्नलिंग गतिविधि कम हो जाती है (चित्र 4c, d)।
GID1b और GID1c रिसेप्टर्स (ऊपर देखें) का वितरण बताता है कि GA रिसेप्टर्स की अलग-अलग अभिव्यक्ति SAM में GA सिग्नलिंग गतिविधि के पैटर्न को आकार देने में मदद करती है। हमें आश्चर्य हुआ कि क्या GA का अलग-अलग संचय शामिल हो सकता है। इस संभावना की जांच करने के लिए, हमने nlsGPS1 GA FRET सेंसर21 का उपयोग किया। 100 मिनट के लिए 10 μM GA4+7 के साथ इलाज किए गए nlsGPS1 के SAM में बढ़ी हुई सक्रियण आवृत्ति का पता चला (पूरक चित्र 9a-e), यह दर्शाता है कि nlsGPS1 SAM में GA सांद्रता में परिवर्तन के प्रति प्रतिक्रिया करता है, जैसा कि यह जड़ों में करता है21। nlsGPS1 सक्रियण आवृत्ति के स्थानिक वितरण ने SAM की बाहरी परतों में अपेक्षाकृत कम GA स्तरों का खुलासा किया, लेकिन दिखाया कि वे SAM के केंद्र और सीमाओं पर बढ़े हुए थे (चित्र 4e और पूरक चित्र 9a,c)। इससे पता चलता है कि GA भी SAM में एक स्थानिक पैटर्न के साथ वितरित किया जाता है जो qmRGA द्वारा प्रकट किए गए पैटर्न के बराबर है। एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हमने SAM को फ्लोरोसेंट GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) या अकेले Fl को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी उपचारित किया। Fl सिग्नल पूरे SAM में वितरित किया गया था, जिसमें केंद्रीय क्षेत्र और प्रिमोर्डियम शामिल था, यद्यपि कम तीव्रता पर (चित्र 4j और अनुपूरक चित्र 10d)। इसके विपरीत, सभी तीन GA-Fl विशेष रूप से प्रिमोर्डियम सीमाओं के भीतर और शेष IPR में अलग-अलग डिग्री तक जमा हुए, जिसमें GA7-Fl IPR में सबसे बड़े डोमेन में जमा हुआ (चित्र 4k और अनुपूरक चित्र 10a,b)। प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिमाणीकरण से पता चला कि Fl-उपचारित SAM की तुलना में GA-Fl-उपचारित SAM में IPR से गैर-IPR तीव्रता का अनुपात अधिक था (चित्र 4l और अनुपूरक चित्र 10c)। इससे पता चलता है कि एसएएम जीए सिग्नलिंग गतिविधि का पैटर्न जीए रिसेप्टर्स की अलग-अलग अभिव्यक्ति और अंग सीमाओं के पास आईपीआर कोशिकाओं में जीए के अलग-अलग संचय दोनों से उत्पन्न होता है। इस प्रकार, हमारे विश्लेषण ने जीए सिग्नलिंग के एक अप्रत्याशित स्थानिक-समय पैटर्न का खुलासा किया, जिसमें एसएएम के केंद्र और प्राइमोर्डियम में कम गतिविधि और परिधीय क्षेत्र में आईपीआर में अधिक गतिविधि थी।
एसएएम में विभेदक जीए सिग्नलिंग गतिविधि की भूमिका को समझने के लिए, हमने एसएएम क्यूएमआरजीए पीसीएलवी3::एमचेरी-एनएलएस की वास्तविक समय की टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग करके जीए सिग्नलिंग गतिविधि, कोशिका विस्तार और कोशिका विभाजन के बीच सहसंबंध का विश्लेषण किया। वृद्धि विनियमन में जीए की भूमिका को देखते हुए, कोशिका विस्तार मापदंडों के साथ एक सकारात्मक सहसंबंध की उम्मीद थी। इसलिए, हमने सबसे पहले जीए सिग्नलिंग गतिविधि मानचित्रों की तुलना कोशिका सतह वृद्धि दर के मानचित्रों (किसी दिए गए सेल के लिए और विभाजन के समय बेटी कोशिकाओं के लिए सेल विस्तार की ताकत के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में) और वृद्धि विषमता के मानचित्रों के साथ की, जो सेल विस्तार की दिशा को मापता है (यहां भी किसी दिए गए सेल के लिए और विभाजन के समय बेटी कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है; चित्र 5ए,बी, विधियां और पूरक विधियां देखें)। एसएएम सेल सतह वृद्धि दर के हमारे मानचित्र पिछले अवलोकनों38,39 के अनुरूप हैं, जिसमें सीमा पर न्यूनतम वृद्धि दर और विकासशील फूलों में अधिकतम वृद्धि दर है (चित्र 5ए)। प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) ने दिखाया कि GA सिग्नलिंग गतिविधि सेल सतह वृद्धि तीव्रता (चित्र 5c) के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित थी। हमने यह भी दिखाया कि GA सिग्नलिंग इनपुट और वृद्धि तीव्रता सहित भिन्नता के मुख्य अक्ष, उच्च CLV3 अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित दिशा के लिए ऑर्थोगोनल थे, जो शेष विश्लेषणों में SAM केंद्र से कोशिकाओं के बहिष्करण की पुष्टि करता है। स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण ने PCA परिणामों (चित्र 5d) की पुष्टि की, यह दर्शाता है कि IPR में उच्च GA सिग्नल के परिणामस्वरूप उच्च कोशिका विस्तार नहीं हुआ। हालांकि, सहसंबंध विश्लेषण ने GA सिग्नलिंग गतिविधि और वृद्धि विषमता (चित्र 5c, d) के बीच एक मामूली सकारात्मक सहसंबंध का खुलासा किया, जो बताता है कि IPR में उच्च GA सिग्नलिंग सेल वृद्धि की दिशा और संभवतः सेल विभाजन तल की स्थिति को प्रभावित करता है।
a, b SAM में औसत सतही वृद्धि (a) और वृद्धि विषमता (b) के हीट मैप सात स्वतंत्र पौधों (क्रमशः सेल विस्तार की ताकत और दिशा के लिए प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किए जाते हैं) पर औसतन होते हैं। c PCA विश्लेषण में निम्नलिखित चर शामिल थे: GA सिग्नल, सतही विकास तीव्रता, सतही विकास विषमता और CLV3 अभिव्यक्ति। PCA घटक 1 मुख्य रूप से सतही विकास तीव्रता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित था और GA सिग्नल के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। PCA घटक 2 मुख्य रूप से सतही विकास विषमता के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित था और CLV3 अभिव्यक्ति के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबंधित था। प्रतिशत प्रत्येक घटक द्वारा समझाए गए बदलाव को दर्शाते हैं। d CZ को छोड़कर ऊतक पैमाने पर GA सिग्नल, सतही विकास तीव्रता और सतही विकास विषमता के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण। 10 घंटे पर SAM (लेकिन प्रिमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका भित्तियों को उनके कोण मानों के अनुसार रंग दिया गया है। रंग पट्टी निचले दाएं कोने में दिखाई गई है। इनसेट 0 घंटे पर इसी 3D छवि को दर्शाता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। बॉक्स प्लॉट IPR और गैर-IPR Col-0 SAM (n = 10 स्वतंत्र पौधे) में कोशिका विभाजन दर प्रदर्शित करते हैं। केंद्र रेखा मध्यिका दिखाती है, और बॉक्स की सीमाएँ 25वें और 75वें प्रतिशतक को दर्शाती हैं। मूंछें R सॉफ़्टवेयर के साथ निर्धारित न्यूनतम और अधिकतम मानों को दर्शाती हैं। P मान वेल्च के दो-पूंछ वाले टी-परीक्षण के साथ प्राप्त किए गए थे। g, h योजनाबद्ध आरेख जो दर्शाता है (g) SAM के केंद्र से रेडियल दिशा के संबंध में नई कोशिका भित्ति (मैजेंटा) के कोण को कैसे मापें (सफेद बिंदीदार रेखा) (केवल न्यून कोण मान, यानी 0-90°, पर विचार किया जाता है), और (h) मेरिस्टेम के भीतर परिधि/पार्श्व और रेडियल दिशाएँ। i क्रमशः SAM (गहरा नीला), IPR (मध्यम नीला), और गैर-IPR (हल्का नीला) में कोशिका विभाजन समतल अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम। P मान दो-पूंछ वाले कोलमोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे। प्रयोग समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था। j क्रमशः P3 (हल्का हरा), P4 (मध्यम हरा), और P5 (गहरा हरा) के आस-पास IPR के कोशिका विभाजन समतल अभिविन्यास के आवृत्ति हिस्टोग्राम।
इसलिए, हमने अगली बार परीक्षण के दौरान नव निर्मित कोशिका भित्तियों की पहचान करके GA सिग्नलिंग और कोशिका विभाजन गतिविधि के बीच सहसंबंध की जांच की (चित्र 5e)। इस दृष्टिकोण ने हमें कोशिका विभाजन की आवृत्ति और दिशा को मापने की अनुमति दी। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि IPR और शेष SAM (गैर-IPR, चित्र 5f) में कोशिका विभाजन की आवृत्ति समान थी, जो दर्शाता है कि IPR और गैर-IPR कोशिकाओं के बीच GA सिग्नलिंग में अंतर कोशिका विभाजन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। यह, और GA सिग्नलिंग और वृद्धि विषमता के बीच सकारात्मक सहसंबंध ने हमें यह विचार करने के लिए प्रेरित किया कि क्या GA सिग्नलिंग गतिविधि कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित कर सकती है। हमने मेरिस्टेम केंद्र और नई कोशिका भित्ति के केंद्र को जोड़ने वाली रेडियल अक्ष के सापेक्ष एक न्यून कोण के रूप में नई कोशिका भित्ति के अभिविन्यास को मापा (चित्र 5e-i) और रेडियल अक्ष के सापेक्ष 90° के करीब कोणों पर कोशिकाओं के विभाजित होने की स्पष्ट प्रवृत्ति देखी, जिसमें सबसे अधिक आवृत्तियाँ 70-80° (23.28%) और 80-90° (22.62%) (चित्र 5e,i) पर देखी गईं, जो परिधि/अनुप्रस्थ दिशा में कोशिका विभाजन के अनुरूप हैं (चित्र 5h)। इस कोशिका विभाजन व्यवहार में GA सिग्नलिंग के योगदान की जाँच करने के लिए, हमने IPR और गैर-IPR में कोशिका विभाजन मापदंडों का अलग-अलग विश्लेषण किया (चित्र 5i)। हमने देखा कि IPR कोशिकाओं में विभाजन कोण वितरण गैर-IPR कोशिकाओं या पूरे SAM में कोशिकाओं से भिन्न था, IPR कोशिकाओं में पार्श्व/वृत्ताकार कोशिका विभाजन का उच्च अनुपात प्रदर्शित होता है, यानी, 70-80 डिग्री और 80-90 डिग्री (क्रमशः 33.86% और 30.71%, इसी अनुपात) (चित्र 5i)। इस प्रकार, हमारे अवलोकनों ने उच्च GA सिग्नलिंग और परिधिगत दिशा के करीब एक कोशिका विभाजन विमान अभिविन्यास के बीच एक संबंध का खुलासा किया, जो GA सिग्नलिंग गतिविधि और विकास विषमता के बीच के संबंध के समान है (चित्र 5c, d)। इस संबंध के स्थानिक संरक्षण को और अधिक स्थापित करने के लिए, हमने P3 से शुरू होने वाले प्रिमोर्डियम के आसपास IPR कोशिकाओं में विभाजन विमान अभिविन्यास को मापा, P3 और P4 के आसपास IPR के विभाजन कोणों ने कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, हालांकि P4 के आसपास IPR में पार्श्व कोशिका विभाजन की बढ़ी हुई आवृत्ति देखी गई (चित्र 5j)। हालांकि, P5 के आसपास IPR कोशिकाओं में, कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो गया, अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति में तेज वृद्धि के साथ (चित्र 5j)। साथ में, ये परिणाम बताते हैं कि GA सिग्नलिंग SAM में कोशिका विभाजन के अभिविन्यास को नियंत्रित कर सकता है, जो पिछली रिपोर्टों40,41 के अनुरूप है कि उच्च GA सिग्नलिंग IPR में कोशिका विभाजन के पार्श्व अभिविन्यास को प्रेरित कर सकता है।
यह अनुमान लगाया गया है कि IPR में कोशिकाएँ प्राइमोर्डिया में शामिल नहीं होंगी, बल्कि इंटरनोड्स में शामिल होंगी2,42,43। IPR में कोशिका विभाजन के अनुप्रस्थ अभिविन्यास के परिणामस्वरूप इंटरनोड्स में एपिडर्मल कोशिकाओं की समानांतर अनुदैर्ध्य पंक्तियों का विशिष्ट संगठन हो सकता है। ऊपर वर्णित हमारे अवलोकन बताते हैं कि GA सिग्नलिंग संभवतः कोशिका विभाजन की दिशा को विनियमित करके इस प्रक्रिया में भूमिका निभाता है।
कई DELLA जीन के कार्य की हानि के परिणामस्वरूप एक संघटनात्मक GA प्रतिक्रिया होती है, और इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए डेला म्यूटेंट का उपयोग किया जा सकता है44। हमने सबसे पहले SAM में पाँच DELLA जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया। GUS लाइन45 के ट्रांसक्रिप्शनल फ़्यूज़न से पता चला कि GAI, RGA, RGL1, और RGL2 (काफ़ी कम हद तक) SAM में व्यक्त किए गए थे (पूरक चित्र 11a-d)। इन सीटू हाइब्रिडाइज़ेशन ने आगे प्रदर्शित किया कि GAI mRNA विशेष रूप से प्राइमोर्डिया और विकासशील फूलों में जमा होता है (पूरक चित्र 11e)। RGL1 और RGL3 mRNA पूरे SAM कैनोपी और पुराने फूलों में पाए गए, जबकि RGL2 mRNA सीमा क्षेत्र में अधिक प्रचुर मात्रा में था (पूरक चित्र 11f-h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM की कॉन्फ़ोकल इमेजिंग ने इन सीटू हाइब्रिडाइज़ेशन द्वारा देखी गई अभिव्यक्ति की पुष्टि की और दिखाया कि RGL3 प्रोटीन SAM के मध्य भाग में जमा होता है (पूरक चित्र 11i)। pRGA::GFP-RGA लाइन का उपयोग करते हुए, हमने यह भी पाया कि RGA प्रोटीन SAM में जमा होता है, लेकिन P4 से शुरू होने वाली सीमा पर इसकी प्रचुरता कम हो जाती है (पूरक चित्र 11j)। उल्लेखनीय रूप से, RGL3 और RGA के अभिव्यक्ति पैटर्न IPR में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि के अनुरूप हैं, जैसा कि qmRGA (चित्र 4) द्वारा पता लगाया गया है। इसके अलावा, ये डेटा संकेत देते हैं कि सभी DELLA SAM में व्यक्त किए जाते हैं और उनकी अभिव्यक्ति सामूहिक रूप से पूरे SAM में फैली हुई है।
इसके बाद हमने वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियंत्रण) और gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 डेला क्विंटपल (ग्लोबल) म्यूटेंट (चित्र 6a, b) में कोशिका विभाजन मापदंडों का विश्लेषण किया। दिलचस्प बात यह है कि हमने वाइल्ड टाइप (चित्र 6c) की तुलना में डेला ग्लोबल म्यूटेंट SAM में कोशिका विभाजन कोण आवृत्तियों के वितरण में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण बदलाव देखा। डेला ग्लोबल म्यूटेंट में यह परिवर्तन 80-90° कोण (34.71% बनाम 24.55%) और, कुछ हद तक, 70-80° कोण (23.78% बनाम 20.18%) की आवृत्ति में वृद्धि के कारण था, यानी अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन के अनुरूप (चित्र 6c)। डेला ग्लोबल म्यूटेंट (चित्र 6c) में गैर-अनुप्रस्थ विभाजन (0-60°) की आवृत्ति भी कम थी। डेला ग्लोबल म्यूटेंट (चित्र 6बी) के एसएएम में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति काफी बढ़ गई थी। जंगली प्रकार की तुलना में डेला ग्लोबल म्यूटेंट में आईपीआर में अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन की आवृत्ति भी अधिक थी (चित्र 6डी)। आईपीआर क्षेत्र के बाहर, जंगली प्रकार में कोशिका विभाजन कोणों का अधिक समान वितरण था, जबकि डेला ग्लोबल म्यूटेंट ने आईपीआर (चित्र 6ई) की तरह स्पर्शरेखीय विभाजन को प्राथमिकता दी। हमने ga2 ऑक्सीडेज (ga2ox) पंचम म्यूटेंट (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, और ga2ox6-2) के एसएएम में कोशिका विभाजन के अभिविन्यास को भी मापा, जो एक GA-निष्क्रिय म्यूटेंट पृष्ठभूमि है जिसमें GA जमा होता है। GA स्तरों में वृद्धि के अनुरूप, पंचम ga2ox उत्परिवर्ती पुष्पक्रम का SAM Col-0 (पूरक चित्र 12a, b) की तुलना में बड़ा था, और Col-0 की तुलना में, पंचम ga2ox SAM ने कोशिका विभाजन कोणों का एक अलग वितरण दिखाया, जिसमें कोण आवृत्ति 50° से 90° तक बढ़ गई, यानी फिर से स्पर्शरेखीय विभाजनों का पक्ष लिया (पूरक चित्र 12a-c)। इस प्रकार, हम दिखाते हैं कि GA सिग्नलिंग और GA संचय की संवैधानिक सक्रियता IPR और SAM के बाकी हिस्सों में पार्श्व कोशिका विभाजन को प्रेरित करती है।
ए, बी पीआई-रंजित लेर (ए) और वैश्विक डेला उत्परिवर्ती (बी) एसएएम की एल 1 परत का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहा है। 10-घंटे की अवधि में एसएएम (लेकिन प्रिमोर्डियम नहीं) में बनी नई कोशिका दीवारें दिखाई गई हैं और उनके कोण मूल्यों के अनुसार रंगीन हैं। इनसेट 0 घंटे में एसएएम दिखाता है। रंग पट्टी निचले दाएं कोने में प्रदर्शित होती है। (बी) में तीर वैश्विक डेला उत्परिवर्ती में संरेखित सेल फ़ाइलों के एक उदाहरण की ओर इशारा करता है। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया था। पूरे एसएएम (डी), आईपीआर (ई), और गैर-आईपीआर (एफ) में लेर और वैश्विक डेला के बीच सेल डिवीजन प्लेन अभिविन्यास के आवृत्ति वितरण की सीई तुलना f, g Col-0 (i) और pCUC2::gai-1-VENUS (j) ट्रांसजेनिक पौधों के PI-रंजित SAM की कन्फोकल छवियों का 3D विज़ुअलाइज़ेशन। पैनल (a, b) 10 घंटे के भीतर SAM में बनी नई कोशिका भित्ति (लेकिन प्राइमोर्डिया नहीं) दिखाते हैं। प्रयोग को समान परिणामों के साथ दो बार दोहराया गया। h–j Col-0 और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के बीच पूरे SAM (h), IPR (i) और गैर-IPR (j) में स्थित कोशिका विभाजन समतल अभिविन्यासों के आवृत्ति वितरण की तुलना। P मान ​​दो-पूंछ वाले कोलमोगोरोव-स्मिर्नोव परीक्षण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।
इसके बाद हमने विशेष रूप से IPR में GA सिग्नलिंग को बाधित करने के प्रभाव का परीक्षण किया। इस उद्देश्य के लिए, हमने VENUS (pCUC2::gai-1-VENUS लाइन में) से जुड़े एक प्रमुख नकारात्मक gai-1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए कोटिलेडन कप 2 (CUC2) प्रमोटर का उपयोग किया। जंगली-प्रकार के SAM में, CUC2 प्रमोटर P4 से आगे SAM में अधिकांश IPRs की अभिव्यक्ति को चलाता है, जिसमें सीमा कोशिकाएँ भी शामिल हैं, और इसी तरह की विशिष्ट अभिव्यक्ति pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में देखी गई (नीचे देखें)। pCUC2::gai-1-VENUS पौधों के SAM या IPR में कोशिका विभाजन कोणों का वितरण जंगली प्रकार से काफी अलग नहीं था, हालाँकि अप्रत्याशित रूप से हमने पाया कि इन पौधों में बिना IPR वाली कोशिकाएँ 80-90° (चित्र 6f-j) की उच्च आवृत्ति पर विभाजित होती हैं।
यह सुझाव दिया गया है कि कोशिका विभाजन की दिशा SAM की ज्यामिति पर निर्भर करती है, विशेष रूप से ऊतक वक्रता द्वारा उत्पन्न तन्यता तनाव46। इसलिए हमने पूछा कि क्या डेला ग्लोबल म्यूटेंट और pCUC2::gai-1-VENUS पौधों में SAM का आकार बदल गया था। जैसा कि पहले बताया गया था12, डेला ग्लोबल म्यूटेंट SAM का आकार जंगली प्रकार (पूरक चित्र 13a, b, d) से बड़ा था। CLV3 और STM RNA के इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन ने डेला म्यूटेंट में मेरिस्टेम विस्तार की पुष्टि की और स्टेम सेल आला (पूरक चित्र 13e, f, h, i) के पार्श्व विस्तार को भी दिखाया। हालाँकि, दोनों जीनोटाइप में SAM वक्रता समान थी (पूरक चित्र 13k, m, n, p)। हमने जंगली प्रकार की तुलना में वक्रता में बदलाव के बिना gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में आकार में इसी तरह की वृद्धि देखी (पूरक चित्र 13c, d, g, j, l, o, p)। डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में सेल डिवीजन ओरिएंटेशन की आवृत्ति भी प्रभावित हुई थी, लेकिन डेला मोनोलिथिक म्यूटेंट (पूरक चित्र 12d-f) की तुलना में कम हद तक। यह खुराक प्रभाव, वक्रता पर प्रभाव की कमी के साथ, यह सुझाव देता है कि डेला क्वाड्रुपल म्यूटेंट में अवशिष्ट RGL3 गतिविधि DELLA गतिविधि के नुकसान के कारण सेल डिवीजन ओरिएंटेशन में परिवर्तन को सीमित करती है और पार्श्व सेल डिवीजनों में परिवर्तन SAM ज्यामिति में परिवर्तन के बजाय GA सिग्नलिंग गतिविधि में परिवर्तन की प्रतिक्रिया में होते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, CUC2 प्रमोटर P4 से शुरू होकर SAM में IPR अभिव्यक्ति को संचालित करता है (पूरक चित्र 14a, b), और इसके विपरीत, pCUC2::gai-1-VENUS SAM का आकार छोटा था लेकिन वक्रता अधिक थी (पूरक चित्र 14c-h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकृति विज्ञान में यह परिवर्तन जंगली प्रकार की तुलना में यांत्रिक तनावों के एक अलग वितरण का परिणाम हो सकता है, जिसमें उच्च परिधीय तनाव SAM केंद्र47 से कम दूरी पर शुरू होते हैं। वैकल्पिक रूप से, pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकृति विज्ञान में परिवर्तन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति48 द्वारा प्रेरित क्षेत्रीय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकता है। दोनों मामलों में, यह कोशिकाओं के परिधीय/अनुप्रस्थ अभिविन्यास में विभाजित होने की संभावना को बढ़ाकर GA सिग्नलिंग में परिवर्तनों के प्रभावों को आंशिक रूप से ऑफसेट कर सकता है, जो हमारे अवलोकनों को स्पष्ट करता है।
कुल मिलाकर, हमारे डेटा से पुष्टि होती है कि उच्च GA सिग्नलिंग IPR में कोशिका विभाजन तल के पार्श्व अभिविन्यास में सक्रिय भूमिका निभाता है। वे यह भी दिखाते हैं कि मेरिस्टेम वक्रता भी IPR में कोशिका विभाजन तल के अभिविन्यास को प्रभावित करती है।
उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि के कारण IPR में विभाजन तल का अनुप्रस्थ अभिविन्यास यह सुझाव देता है कि GA SAM के भीतर एपिडर्मिस में एक रेडियल सेल फ़ाइल को पहले से व्यवस्थित करता है ताकि सेलुलर संगठन को परिभाषित किया जा सके जो बाद में एपिडर्मल इंटरनोड में पाया जाएगा। वास्तव में, डेला ग्लोबल म्यूटेंट (चित्र 6 बी) की SAM छवियों में ऐसी सेल फ़ाइलें अक्सर दिखाई देती थीं। इस प्रकार, SAM में GA सिग्नलिंग के स्थानिक पैटर्न के विकासात्मक कार्य का और अधिक पता लगाने के लिए, हमने वाइल्ड-टाइप (Ler और Col-0), डेला ग्लोबल म्यूटेंट और pCUC2::gai-1-VENUS ट्रांसजेनिक पौधों में IPR में कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग किया।
हमने पाया कि qmRGA ने दिखाया कि IPR में GA सिग्नलिंग गतिविधि P1/P2 से बढ़ी और P4 पर चरम पर पहुंच गई, और यह पैटर्न समय के साथ स्थिर रहा (चित्र 4a-f और अनुपूरक चित्र 8c-f, k)। बढ़ते GA सिग्नल के साथ IPR में कोशिकाओं के स्थानिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए, हमने पहले अवलोकन के 34 घंटे बाद विश्लेषण किए गए उनके विकासात्मक भाग्य के अनुसार P4 के ऊपर और किनारों पर Ler IPR कोशिकाओं को लेबल किया, यानी, दो से अधिक प्लास्टिड समय, जिससे हमें P1/P2 से P4 तक प्रिमोर्डियम विकास के दौरान IPR कोशिकाओं का अनुसरण करने की अनुमति मिली। हमने तीन अलग-अलग रंगों का इस्तेमाल किया: पीला उन कोशिकाओं के लिए जो P4 के पास प्रिमोर्डियम में एकीकृत थीं जैसा कि अपेक्षित था, जब ये कोशिकाएँ विभाजित हुईं, तो उन्होंने मुख्य रूप से अनुप्रस्थ विभाजन तल (चित्र 7a-c) के माध्यम से ऐसा किया। Col-0 SAM (P3 पर ध्यान केंद्रित करते हुए, जिसकी सीमा Ler में P4 के समान ही मुड़ी हुई है) का उपयोग करके समान परिणाम प्राप्त किए गए, हालाँकि इस जीनोटाइप में पुष्प सीमा पर बनी तह ने IPR कोशिकाओं को अधिक तेज़ी से छिपा दिया (चित्र 7g-i)। इस प्रकार, IPR कोशिकाओं का विभाजन पैटर्न कोशिकाओं को रेडियल पंक्तियों में पहले से व्यवस्थित करता है, जैसा कि इंटरनोड्स में होता है। रेडियल पंक्तियों का संगठन और क्रमिक अंगों के बीच IPR कोशिकाओं का स्थानीयकरण यह सुझाव देता है कि ये कोशिकाएँ इंटरनोडल पूर्वज हैं।
यहाँ, हमने एक अनुपातमितीय GA सिग्नलिंग बायोसेंसर, qmRGA विकसित किया है, जो संयुक्त GA और GA रिसेप्टर सांद्रता से उत्पन्न GA सिग्नलिंग गतिविधि की मात्रात्मक मैपिंग की अनुमति देता है, जबकि अंतर्जात सिग्नलिंग मार्गों के साथ हस्तक्षेप को कम करता है, जिससे सेलुलर स्तर पर GA फ़ंक्शन के बारे में जानकारी मिलती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक संशोधित DELLA प्रोटीन, mRGA का निर्माण किया, जिसने DELLA इंटरैक्शन भागीदारों को बांधने की क्षमता खो दी है, लेकिन GA-प्रेरित प्रोटियोलिसिस के प्रति संवेदनशील बना हुआ है। qmRGA GA स्तरों में बहिर्जात और अंतर्जात दोनों परिवर्तनों पर प्रतिक्रिया करता है, और इसके गतिशील संवेदन गुण विकास के दौरान GA सिग्नलिंग गतिविधि में स्थानिक परिवर्तनों का आकलन करने में सक्षम बनाते हैं। qmRGA एक बहुत ही लचीला उपकरण भी है क्योंकि इसे इसके अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रमोटर को बदलकर (यदि आवश्यक हो) विभिन्न ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और GA सिग्नलिंग मार्ग की संरक्षित प्रकृति और एंजियोस्पर्म में PFYRE रूपांकन को देखते हुए, यह अन्य प्रजातियों में स्थानांतरित होने की संभावना है22। इसके अनुरूप, चावल SLR1 DELLA प्रोटीन (HYY497AAA) में एक समतुल्य उत्परिवर्तन भी SLR1 की वृद्धि दमनकारी गतिविधि को दबाने के लिए दिखाया गया था, जबकि केवल mRGA23 के समान, इसके GA-मध्यस्थ गिरावट को थोड़ा कम करता है। उल्लेखनीय रूप से, अरेबिडोप्सिस में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PFYRE डोमेन (S474L) में एक एकल अमीनो एसिड उत्परिवर्तन ने प्रतिलेखन कारक भागीदारों के साथ बातचीत करने की इसकी क्षमता को प्रभावित किए बिना RGA की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बदल दिया। हालांकि यह उत्परिवर्तन mRGA में मौजूद 3 अमीनो एसिड प्रतिस्थापनों के बहुत करीब है, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि ये दो उत्परिवर्तन DELLA की विशिष्ट विशेषताओं को बदलते हैं। हालाँकि अधिकांश प्रतिलेखन कारक भागीदार DELLA26,51 के LHR1 और SAW डोमेन से जुड़ते हैं, PFYRE डोमेन में कुछ संरक्षित अमीनो एसिड इन इंटरैक्शन को स्थिर करने में मदद कर सकते हैं।
इंटरनोड विकास पौधे की संरचना और उपज सुधार में एक महत्वपूर्ण विशेषता है। qmRGA ने IPR इंटरनोड प्रोजेनिटर कोशिकाओं में उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का खुलासा किया। मात्रात्मक इमेजिंग और आनुवंशिकी के संयोजन से, हमने दिखाया कि GA सिग्नलिंग पैटर्न SAM एपिडर्मिस में वृत्ताकार/अनुप्रस्थ कोशिका विभाजन तलों को सुपरइम्पोज़ करते हैं, जो इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक कोशिका विभाजन संगठन को आकार देते हैं। विकास के दौरान कोशिका विभाजन तल अभिविन्यास के कई नियामकों की पहचान की गई है52,53। हमारा काम इस बात का स्पष्ट उदाहरण प्रदान करता है कि GA सिग्नलिंग गतिविधि इस सेलुलर पैरामीटर को कैसे नियंत्रित करती है। DELLA प्रीफ़ोल्डिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स41 के साथ बातचीत कर सकता है, इसलिए GA सिग्नलिंग कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास40,41,54,55 को सीधे प्रभावित करके सेल डिवीजन प्लेन अभिविन्यास को विनियमित कर सकता है। हमने अप्रत्याशित रूप से दिखाया कि SAM में, उच्च GA सिग्नलिंग गतिविधि का सहसंबंध सेल बढ़ाव या विभाजन नहीं था, बल्कि केवल वृद्धि विषमता थी, जो IPR में सेल विभाजन की दिशा पर GA के प्रत्यक्ष प्रभाव के अनुरूप है। हालांकि, हम इस बात को खारिज नहीं कर सकते कि यह प्रभाव अप्रत्यक्ष भी हो सकता है, उदाहरण के लिए GA-प्रेरित सेल वॉल सॉफ्टनिंग56 द्वारा मध्यस्थता। सेल वॉल गुणों में परिवर्तन यांत्रिक तनाव57,58 को प्रेरित करते हैं, जो कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल39,46,59 के अभिविन्यास को प्रभावित करके सेल डिवीजन प्लेन के अभिविन्यास को भी प्रभावित कर सकता है। GA-प्रेरित यांत्रिक तनाव और GA द्वारा माइक्रोट्यूब्यूल अभिविन्यास के प्रत्यक्ष विनियमन के संयुक्त प्रभाव इंटरनोड्स को परिभाषित करने के लिए IPR में सेल डिवीजन अभिविन्यास के एक विशिष्ट पैटर्न को उत्पन्न करने में शामिल हो सकते हैं, और इस विचार का परीक्षण करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है। इसी तरह, पिछले अध्ययनों ने इंटरनोड गठन60,61 के नियंत्रण में DELLA-इंटरैक्टिंग प्रोटीन TCP14 और 15 के महत्व पर प्रकाश डाला है और ये कारक BREVIPEDICELLUS (BP) और PENNYWISE (PNY) के साथ GA की क्रिया को मध्यस्थ कर सकते हैं, जो इंटरनोड विकास को नियंत्रित करते हैं और GA सिग्नलिंग2,62 को प्रभावित करते हैं। यह देखते हुए कि DELLAs ब्रैसिनोस्टेरॉइड, एथिलीन, जैस्मोनिक एसिड और एब्सिसिक एसिड (ABA) सिग्नलिंग मार्गों63,64 के साथ परस्पर क्रिया करते हैं और ये हार्मोन सूक्ष्मनलिका अभिविन्यास65 को प्रभावित कर सकते हैं, कोशिका विभाजन अभिविन्यास पर GA के प्रभाव को अन्य हार्मोनों द्वारा भी मध्यस्थ किया जा सकता है।
प्रारंभिक कोशिका विज्ञान संबंधी अध्ययनों से पता चला है कि एराबिडोप्सिस एसएएम के आंतरिक और बाहरी दोनों क्षेत्र इंटरनोड विकास के लिए आवश्यक हैं2,42। तथ्य यह है कि जीए आंतरिक ऊतकों में कोशिका विभाजन को सक्रिय रूप से नियंत्रित करता है12 एसएएम में मेरिस्टेम और इंटरनोड आकार को विनियमित करने में जीए के दोहरे कार्य का समर्थन करता है। दिशात्मक कोशिका विभाजन का पैटर्न भी आंतरिक एसएएम ऊतक में कसकर विनियमित होता है, और यह विनियमन स्टेम वृद्धि52 के लिए आवश्यक है। यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या जीए आंतरिक एसएएम संगठन में कोशिका विभाजन तल को उन्मुख करने में भी भूमिका निभाता है, जिससे एसएएम के भीतर इंटरनोड्स के विनिर्देशन और विकास को सिंक्रनाइज़ किया जा सके।
पौधों को मिट्टी या 1x मुराशिगे-स्कोग (एमएस) माध्यम (डचेफा) में इन विट्रो में उगाया गया था, जिसमें 1% सुक्रोज और 1% अगर (सिग्मा) के साथ मानक स्थितियों (16 घंटे प्रकाश, 22 डिग्री सेल्सियस) के तहत पूरक किया गया था, हाइपोकोटिल और जड़ वृद्धि प्रयोगों को छोड़कर जिसमें अंकुर निरंतर प्रकाश और 22 डिग्री सेल्सियस के तहत ऊर्ध्वाधर प्लेटों पर उगाए गए थे। नाइट्रेट प्रयोगों के लिए, पौधों को संशोधित एमएस माध्यम (बायोवर्ल्ड प्लांट माध्यम) पर पर्याप्त नाइट्रेट (0 या 10 मिमी KNO3), 0.5 मिमी NH4-सक्सीनेट, 1% सुक्रोज और 1% ए-अगर (सिग्मा) के साथ लंबे दिन की स्थितियों के तहत पूरक किया गया था।
pDONR221 में डाले गए GID1a cDNA को pDONR P4-P1R-pUBQ10 और pDONR P2R-P3-mCherry के साथ pB7m34GW में पुनः संयोजित किया गया ताकि pUBQ10::GID1a-mCherry उत्पन्न किया जा सके। pDONR221 में डाले गए IDD2 DNA को pB7RWG266 में पुनः संयोजित किया गया ताकि p35S:IDD2-RFP उत्पन्न किया जा सके। pGID1b::2xmTQ2-GID1b उत्पन्न करने के लिए, GID1b कोडिंग क्षेत्र के अपस्ट्रीम में 3.9 kb खंड और GID1b cDNA (1.3 kb) और टर्मिनेटर (3.4 kb) युक्त 4.7 kb खंड को पहले पूरक तालिका 3 में प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया और फिर क्रमशः pDONR P4-P1R (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और pDONR P2R-P3 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में डाला गया, और अंत में गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करके pGreen 012567 लक्ष्य वेक्टर में pDONR221 2xmTQ268 के साथ पुनर्संयोजित किया गया। pCUC2::LSSmOrange उत्पन्न करने के लिए, CUC2 प्रमोटर अनुक्रम (ATG के 3229 bp अपस्ट्रीम) के बाद बड़े स्टोक्स-शिफ्टेड mOrange (LSSmOrange)69 के कोडिंग अनुक्रम को N7 न्यूक्लियर लोकलाइज़ेशन सिग्नल और NOS ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेटर के साथ गेटवे 3-फ़्रैगमेंट रीकॉम्बिनेशन सिस्टम (इंविट्रोजन) का उपयोग करके pGreen कैनामाइसिन टार्गेटिंग वेक्टर में इकट्ठा किया गया। प्लांट बाइनरी वेक्टर को एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफ़ैसियंस स्ट्रेन GV3101 में पेश किया गया और एग्रोबैक्टीरियम इन्फ़िलट्रेशन विधि द्वारा निकोटियाना बेंथमियाना पत्तियों में और फ्लोरल डिप विधि द्वारा अरेबिडोप्सिस थालियाना कोल-0 में पेश किया गया। pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry और pCLV3::mCherry-NLS qmRGA को क्रमशः संबंधित क्रॉस के F3 और F1 प्रोजेनी से अलग किया गया।
आरएनए इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन लगभग 1 सेमी लंबे शूट टिप्स72 पर किया गया था, जिन्हें एकत्र किया गया और तुरंत एफएए समाधान (3.7% फॉर्मेल्डिहाइड, 5% एसिटिक एसिड, 50% इथेनॉल) में स्थिर किया गया, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस तक पहले से ठंडा किया गया था। 2 × 15 मिनट के वैक्यूम उपचार के बाद, फिक्सेटिव को बदल दिया गया और नमूनों को रात भर इनक्यूबेट किया गया। GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, और RGL3 cDNA और उनके 3'-UTRs के लिए एंटीसेंस जांच को पूरक तालिका 3 में दिखाए गए प्राइमरों का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था जैसा कि रोसियर एट अल.73 द्वारा वर्णित किया गया है। डिगोक्सीजेनिन-लेबल जांचों को डिगोक्सीजेनिन एंटीबॉडी (3000 गुना कमजोर पड़ने; रोश, कैटलॉग संख्या: 11 093 274 910) का उपयोग करके प्रतिरक्षा का पता लगाया गया था, और वर्गों को 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी, 250 गुना कमजोर पड़ने) / नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी, 200 गुना कमजोर पड़ने) समाधान के साथ दाग दिया गया था।