सूखे की स्थिति में सरसों की वृद्धि को नियंत्रित करने वाले कारकों की जीनोम-व्यापी पहचान और अभिव्यक्ति विश्लेषण

गुइझोऊ प्रांत में वर्षा का मौसमी वितरण असमान है, वसंत और ग्रीष्म ऋतु में अधिक वर्षा होती है, लेकिन सरसों के पौधे शरद ऋतु और शीत ऋतु में सूखे के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिससे उपज गंभीर रूप से प्रभावित होती है। सरसों एक विशेष तिलहन फसल है जो मुख्य रूप से गुइझोऊ प्रांत में उगाई जाती है। इसमें सूखे को सहने की प्रबल क्षमता होती है और इसे पर्वतीय क्षेत्रों में उगाया जा सकता है। यह सूखा-प्रतिरोधी जीनों का एक समृद्ध स्रोत है। सरसों की किस्मों में सुधार और जर्मप्लाज्म संसाधनों में नवाचार के लिए सूखा-प्रतिरोधी जीनों की खोज अत्यंत महत्वपूर्ण है। जीआरएफ परिवार पौधों की वृद्धि और विकास तथा सूखे के प्रति प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वर्तमान में, जीआरएफ जीन अरेबिडोप्सिस 2, चावल (ओरिज़ा सैटिवा) 12, सरसों 13, कपास (गोसिपियम हिरसुटम) 14, गेहूं (ट्रिटिकम एस्टाइवम) 15, बाजरा (सेटेरिया इटालिका) 16 और ब्रासिका 17 में पाए गए हैं, लेकिन सरसों में जीआरएफ जीन पाए जाने की कोई रिपोर्ट नहीं है। इस अध्ययन में, सरसों के जीआरएफ परिवार के जीनों की पहचान जीनोम स्तर पर की गई और उनके भौतिक और रासायनिक गुणों, विकासवादी संबंधों, समरूपता, संरक्षित रूपांकनों, जीन संरचना, जीन दोहराव, सिस-तत्वों और अंकुरण अवस्था (चार-पत्ती अवस्था) का विश्लेषण किया गया। सूखे के तनाव के तहत अभिव्यक्ति पैटर्न का व्यापक विश्लेषण किया गया ताकि सूखे के प्रति प्रतिक्रिया में बीजीजीआरएफ जीनों के संभावित कार्य पर आगे के अध्ययनों के लिए एक वैज्ञानिक आधार प्रदान किया जा सके और सूखा-सहिष्णु सरसों के प्रजनन के लिए उम्मीदवार जीन प्रदान किए जा सकें।
ब्रासिका जुनसिया जीनोम में दो एचएमएमईआर खोजों का उपयोग करके चौंतीस बीजेजीआरएफ जीन की पहचान की गई, जिनमें से सभी में क्यूएलक्यू और डब्ल्यूआरसी डोमेन मौजूद हैं। पहचाने गए बीजेजीआरएफ जीन के सीडीएस अनुक्रम अनुपूरक तालिका एस1 में प्रस्तुत किए गए हैं। बीजेजीआरएफ01-बीजेजीआरएफ34 का नामकरण गुणसूत्र पर उनकी स्थिति के आधार पर किया गया है। इस परिवार के भौतिक रासायनिक गुण दर्शाते हैं कि अमीनो अम्ल की लंबाई अत्यधिक परिवर्तनशील है, जो 261 अमीनो एसिड (बीजेजीआरएफ19) से लेकर 905 अमीनो एसिड (बीजेजीआरएफ28) तक है। बीजेजीआरएफ का समविद्युत बिंदु 6.19 (बीजेजीआरएफ02) से लेकर 9.35 (बीजेजीआरएफ03) तक है, जिसका औसत 8.33 है, और बीजेजीआरएफ का 88.24% एक क्षारीय प्रोटीन है। BjGRF की अनुमानित आणविक भार सीमा 29.82 kDa (BjGRF19) से 102.90 kDa (BjGRF28) तक है; BjGRF प्रोटीन का अस्थिरता सूचकांक 51.13 (BjGRF08) से 78.24 (BjGRF19) तक है, ये सभी 40 से अधिक हैं, जो दर्शाता है कि वसा अम्ल सूचकांक 43.65 (BjGRF01) से 78.78 (BjGRF22) तक है, औसत जल-निद्रा (GRAVY) -1.07 (BjGRF31) से -0.45 (BjGRF22) तक है, सभी जल-निद्रा वाले BjGRF प्रोटीनों में नकारात्मक GRAVY मान होते हैं, जो अवशेषों के कारण जल-निद्रा की कमी के कारण हो सकता है। सबसेलुलर स्थानीयकरण भविष्यवाणी से पता चला कि 31 BjGRF एन्कोडेड प्रोटीन नाभिक में स्थानीयकृत हो सकते हैं, BjGRF04 पेरोक्सिसोम में स्थानीयकृत हो सकता है, BjGRF25 साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत हो सकता है, और BjGRF28 क्लोरोप्लास्ट में स्थानीयकृत हो सकता है (तालिका 1), यह दर्शाता है कि BjGRF नाभिक में स्थानीयकृत हो सकते हैं और एक प्रतिलेखन कारक के रूप में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभा सकते हैं।
विभिन्न प्रजातियों में जीआरएफ परिवारों का फाइलोजेनेटिक विश्लेषण जीन कार्यों के अध्ययन में सहायक हो सकता है। इसलिए, 35 रेपसीड, 16 शलजम, 12 चावल, 10 बाजरा और 9 अरेबिडोप्सिस जीआरएफ के पूर्ण-लंबाई वाले अमीनो एसिड अनुक्रमों को डाउनलोड किया गया और 34 पहचाने गए बीजेजीआरएफ जीनों के आधार पर एक फाइलोजेनेटिक वृक्ष का निर्माण किया गया (चित्र 1)। तीनों उपपरिवारों में सदस्यों की संख्या भिन्न-भिन्न है; 116 जीआरएफ टीएफ को तीन अलग-अलग उपपरिवारों (समूह ए~सी) में विभाजित किया गया है, जिनमें क्रमशः 59 (50.86%), 34 (29.31%) और 23 (19.83%) जीआरएफ शामिल हैं। इनमें से, 34 बीजेजीआरएफ परिवार के सदस्य 3 उपपरिवारों में फैले हुए हैं: समूह ए में 13 सदस्य (38.24%), समूह बी में 12 सदस्य (35.29%) और समूह सी में 9 सदस्य (26.47%)। सरसों के बहुगुणन की प्रक्रिया में, विभिन्न उपपरिवारों में BjGRFs जीनों की संख्या भिन्न होती है, और जीन प्रवर्धन और हानि हो सकती है। यह उल्लेखनीय है कि समूह C में चावल और बाजरा के GRFs का वितरण नहीं है, जबकि समूह B में 2 चावल GRFs और 1 बाजरा GRF हैं, और अधिकांश चावल और बाजरा GRFs एक ही शाखा में समूहीकृत हैं, जो दर्शाता है कि BjGRFs द्विबीजपत्री पौधों से निकटता से संबंधित हैं। इनमें से, अरेबिडोप्सिस थालियाना में GRF कार्य पर किए गए सबसे गहन अध्ययन BjGRFs के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए आधार प्रदान करते हैं।
सरसों का फाइलोजेनेटिक वृक्ष जिसमें ब्रासिका नैपस, चावल, बाजरा और अरेबिडोप्सिस थालियाना जीआरएफ परिवार के सदस्य शामिल हैं।
सरसों के जीआरएफ परिवार में दोहराए जाने वाले जीनों का विश्लेषण। पृष्ठभूमि में धूसर रेखा सरसों के जीनोम में एक सिंक्रनाइज़्ड ब्लॉक को दर्शाती है, लाल रेखा BjGRF जीन के खंडित दोहरावों की एक जोड़ी को दर्शाती है;
चौथे पत्ते की अवस्था में सूखे के तनाव के तहत BjGRF जीन की अभिव्यक्ति। qRT-PCR डेटा पूरक तालिका S5 में दिखाया गया है। डेटा में महत्वपूर्ण अंतर छोटे अक्षरों में दर्शाए गए हैं।
वैश्विक जलवायु परिवर्तन के कारण, फसलों द्वारा सूखे के तनाव से निपटने के तरीकों का अध्ययन करना और उनकी सहनशीलता तंत्र को बेहतर बनाना एक महत्वपूर्ण शोध विषय बन गया है।18 सूखे के बाद, पौधों की आकारिकीय संरचना, जीन अभिव्यक्ति और चयापचय प्रक्रियाओं में परिवर्तन होता है, जिससे प्रकाश संश्लेषण रुक सकता है और चयापचय संबंधी गड़बड़ी हो सकती है, जो फसलों की उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करती है।19,20,21 पौधे सूखे के संकेतों को महसूस करते हैं, तो वे Ca2+ और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल जैसे द्वितीयक संदेशवाहक उत्पन्न करते हैं, जिससे अंतःकोशिकीय कैल्शियम आयन सांद्रता बढ़ जाती है और प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन मार्ग के नियामक नेटवर्क को सक्रिय करते हैं।22,23 अंतिम लक्ष्य प्रोटीन सीधे कोशिकीय रक्षा में शामिल होता है या टीएफ के माध्यम से संबंधित तनाव जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जिससे पौधों की तनाव के प्रति सहनशीलता बढ़ती है।24,25 इस प्रकार, टीएफ सूखे के तनाव के प्रति प्रतिक्रिया करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सूखे के तनाव के प्रति प्रतिक्रियाशील टीएफ के अनुक्रम और डीएनए बंधन गुणों के अनुसार, टीएफ को विभिन्न परिवारों में विभाजित किया जा सकता है, जैसे कि जीआरएफ, ईआरएफ, एमवाईबी, डब्ल्यूआरकेवाई और अन्य परिवार।26
जीआरएफ जीन परिवार एक प्रकार का पादप-विशिष्ट टीएफ है जो वृद्धि, विकास, संकेत संचरण और पादप रक्षा प्रतिक्रियाओं जैसे विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।27 ओ. सैटिवा28 में पहले जीआरएफ जीन की पहचान के बाद से, कई प्रजातियों में अधिकाधिक जीआरएफ जीन की पहचान की गई है और यह दिखाया गया है कि वे पादप वृद्धि, विकास और तनाव प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं।8, 29, 30,31,32 ब्रासिका जुनसिया जीनोम अनुक्रम के प्रकाशन के साथ, बीजीजीआरएफ जीन परिवार की पहचान संभव हो गई।33 इस अध्ययन में, संपूर्ण सरसों जीनोम में 34 बीजीजीआरएफ जीन की पहचान की गई और गुणसूत्रीय स्थिति के आधार पर उन्हें बीजीजीआरएफ01-बीजीजीआरएफ34 नाम दिया गया। इन सभी में अत्यधिक संरक्षित क्यूएलक्यू और डब्ल्यूआरसी डोमेन होते हैं। भौतिक रासायनिक गुणों के विश्लेषण से पता चला कि बीजीजीआरएफ प्रोटीन (बीजीजीआरएफ28 को छोड़कर) की अमीनो अम्ल संख्या और आणविक भार में अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे, जो दर्शाता है कि बीजीजीआरएफ परिवार के सदस्यों के कार्य समान हो सकते हैं। जीन संरचना विश्लेषण से पता चला कि 64.7% BjGRF जीनों में 4 एक्सॉन मौजूद थे, जो दर्शाता है कि विकास में BjGRF जीन संरचना अपेक्षाकृत संरक्षित है, लेकिन BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 और BjGRF29 जीनों में एक्सॉन की संख्या अधिक है। अध्ययनों से पता चला है कि एक्सॉन या इंट्रॉन के जुड़ने या हटने से जीन संरचना और कार्य में अंतर आ सकता है, जिससे नए जीन बनते हैं34,35,36। इसलिए, हमारा अनुमान है कि विकास के दौरान BjGRF का इंट्रॉन लुप्त हो गया होगा, जिससे जीन के कार्य में परिवर्तन हो सकता है। मौजूदा अध्ययनों के अनुरूप, हमने यह भी पाया कि इंट्रॉन की संख्या जीन अभिव्यक्ति से संबंधित है। जब किसी जीन में इंट्रॉन की संख्या अधिक होती है, तो जीन विभिन्न प्रतिकूल कारकों के प्रति शीघ्रता से प्रतिक्रिया कर सकता है।
जीन दोहराव जीनोमिक और आनुवंशिक विकास में एक प्रमुख कारक है37। संबंधित अध्ययनों से पता चला है कि जीन दोहराव न केवल जीआरएफ जीनों की संख्या बढ़ाता है, बल्कि पौधों को विभिन्न प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों के अनुकूल बनाने में मदद करने के लिए नए जीन उत्पन्न करने का एक साधन भी है38। इस अध्ययन में कुल 48 दोहराव वाले जीन जोड़े पाए गए, जिनमें से सभी खंडीय दोहराव थे, जो यह दर्शाता है कि खंडीय दोहराव इस परिवार में जीनों की संख्या बढ़ाने का प्रमुख तंत्र है। साहित्य में यह बताया गया है कि खंडीय दोहराव अरेबिडोप्सिस और स्ट्रॉबेरी में जीआरएफ जीन परिवार के सदस्यों के प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से बढ़ावा दे सकता है, और किसी भी प्रजाति में इस जीन परिवार का कोई टैंडम दोहराव नहीं पाया गया27,39। इस अध्ययन के परिणाम अरेबिडोप्सिस थालियाना और स्ट्रॉबेरी परिवारों पर मौजूदा अध्ययनों के अनुरूप हैं, जो यह सुझाव देते हैं कि जीआरएफ परिवार विभिन्न पौधों में खंडीय दोहराव के माध्यम से जीनों की संख्या बढ़ा सकता है और नए जीन उत्पन्न कर सकता है।
इस अध्ययन में, सरसों में कुल 34 BjGRF जीन की पहचान की गई, जिन्हें 3 उपपरिवारों में विभाजित किया गया। इन जीनों में समान संरक्षित रूपांकन और जीन संरचनाएं पाई गईं। कोलिनियरिटी विश्लेषण से सरसों में 48 युग्म खंड दोहराव का पता चला। BjGRF प्रमोटर क्षेत्र में प्रकाश प्रतिक्रिया, हार्मोनल प्रतिक्रिया, पर्यावरणीय तनाव प्रतिक्रिया और वृद्धि एवं विकास से संबंधित सिस-एक्टिंग तत्व मौजूद हैं। सरसों के अंकुरण अवस्था (जड़ें, तने, पत्तियां) में 34 BjGRF जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया, और सूखे की स्थिति में 10 BjGRF जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन किया गया। यह पाया गया कि सूखे के तनाव में BjGRF जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न समान थे और संभवतः सूखे के प्रति प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने में समान भूमिका निभाते हैं। BjGRF03 और BjGRF32 जीन सूखे के तनाव में सकारात्मक नियामक भूमिका निभा सकते हैं, जबकि BjGRF06 और BjGRF23 जीन miR396 के लक्ष्य जीन के रूप में सूखे के तनाव में भूमिका निभाते हैं। कुल मिलाकर, हमारा अध्ययन ब्रैसिकेसी कुल के पौधों में BjGRF जीन के कार्य की भविष्य में खोज के लिए एक जैविक आधार प्रदान करता है।
इस प्रयोग में प्रयुक्त सरसों के बीज गुइझोऊ कृषि विज्ञान अकादमी के गुइझोऊ तेल बीज अनुसंधान संस्थान द्वारा उपलब्ध कराए गए थे। साबुत बीजों का चयन करके उन्हें मिट्टी में बोया गया (मिट्टी और मिट्टी का अनुपात 3:1 था), और चार पत्ती अवस्था आने के बाद जड़ों, तनों और पत्तियों को एकत्र किया गया। पौधों को सूखे की स्थिति का अनुकरण करने के लिए 20% PEG 6000 से उपचारित किया गया, और पत्तियों को 0, 3, 6, 12 और 24 घंटे बाद एकत्र किया गया। सभी पौधों के नमूनों को तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दिया गया और फिर अगले परीक्षण के लिए -80°C फ्रीजर में संग्रहित किया गया।
इस अध्ययन के दौरान प्राप्त या विश्लेषण किए गए सभी डेटा प्रकाशित लेख और पूरक सूचना फाइलों में शामिल हैं।