ज्वार में लक्षित पत्ती धब्बा रोग के प्रति एमएएमपी-प्रेरित रक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरोध की शक्ति का जीनोम-व्यापी सहसंबंध विश्लेषण

पौधे और रोगजनक सामग्री

सोरघम कन्वर्जन पॉपुलेशन (एससीपी) के नाम से जानी जाने वाली सोरघम एसोसिएशन मैपिंग पॉपुलेशन, इलिनोइस विश्वविद्यालय (अब यूसी डेविस) के डॉ. पैट ब्राउन द्वारा प्रदान की गई थी। इसका वर्णन पहले किया जा चुका है और यह विविध किस्मों का संग्रह है जिन्हें प्रकाश-अवधि के प्रति असंवेदनशील और छोटे कद में परिवर्तित किया गया है ताकि अमेरिकी वातावरण में पौधों की वृद्धि और विकास को सुगम बनाया जा सके। इस अध्ययन में इस पॉपुलेशन की 510 किस्मों का उपयोग किया गया था, हालांकि खराब अंकुरण और अन्य गुणवत्ता नियंत्रण समस्याओं के कारण, सभी किस्मों का उपयोग तीनों लक्षणों के विश्लेषण में नहीं किया जा सका। अंततः, 345 किस्मों के डेटा का उपयोग चिटिन प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए, 472 किस्मों का flg22 प्रतिक्रिया के लिए और 456 किस्मों का TLS प्रतिरोध के विश्लेषण के लिए किया गया।बी. कुकीस्ट्रेन LSLP18 को अर्कांसस विश्वविद्यालय के डॉ. बर्ट ब्लूहम से प्राप्त किया गया था।

एमएएमपी प्रतिक्रिया माप

इस अध्ययन में दो अलग-अलग MAMPs (मल्टी-एम्प्लॉयड मेटास्टैटिक कंपाउंड) का उपयोग किया गया: flg22 (जेनस्क्रिप्ट कैटलॉग# RP19986) और चिटिन। ग्रीनहाउस में मिट्टी (33% सनशाइन रेडी-अर्थ प्रो ग्रोइंग मिक्स) से भरे फ्लैट्स पर रखे इंसर्ट में ज्वार के पौधे उगाए गए। नमूना संग्रह से एक दिन पहले पौधों को पानी दिया गया ताकि संग्रह के दिन पत्तियों में अतिरिक्त नमी न रहे।

किस्मों को यादृच्छिक रूप से चुना गया और व्यवस्था संबंधी कारणों से, उन्हें 60 किस्मों के बैच में बोया गया। प्रत्येक किस्म के लिए, तीन गमलों में प्रति किस्म दो बीज बोए गए। जैसे ही पिछले बैच की प्रक्रिया पूरी हुई, अगले बैच बोए गए, जब तक कि पूरी आबादी का आकलन नहीं हो गया। दोनों एमएएमपी के लिए दो प्रायोगिक परीक्षण किए गए, जिनमें से प्रत्येक परीक्षण में जीनोटाइप को पुनः यादृच्छिक रूप से चुना गया।

आरओएस परीक्षण पूर्व वर्णित विधि के अनुसार किए गए। संक्षेप में, प्रत्येक किस्म के लिए, छह बीजों को 3 अलग-अलग गमलों में बोया गया। परिणामस्वरूप प्राप्त पौधों में से, एकरूपता के आधार पर तीन का चयन किया गया। जो पौधे असामान्य दिखते थे या अधिकांश पौधों की तुलना में काफी लंबे या छोटे थे, उनका उपयोग नहीं किया गया। तीन अलग-अलग 15 दिन पुराने ज्वार के पौधों की चौथी पत्ती के सबसे चौड़े भाग से 3 मिमी व्यास के चार पत्ती डिस्क निकाले गए। दो पौधों से प्रति पत्ती एक डिस्क और एक पौधे से दो डिस्क लिए गए, जिसमें दूसरा डिस्क जल नियंत्रण के रूप में रखा गया (नीचे देखें)। डिस्क को अलग-अलग 50 µl H2O पर एक काली 96-वेल प्लेट में तैराया गया, जिसे प्रकाश के संपर्क से बचाने के लिए एल्यूमीनियम सील से बंद कर दिया गया और रात भर कमरे के तापमान पर रखा गया। अगली सुबह, 2 मिलीग्राम/मिलीलीटर केमिल्यूमिनेसेंट प्रोब L-012 (वाको, कैटलॉग # 120-04891), 2 मिलीग्राम/मिलीलीटर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (टाइप VI-A, सिग्मा-एल्ड्रिच, कैटलॉग # P6782), और 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर चिटिन या 2 μM Flg22 का उपयोग करके एक प्रतिक्रिया घोल तैयार किया गया। इस प्रतिक्रिया घोल के 50 µl को चार में से तीन कुओं में डाला गया। चौथा कुआँ एक मॉक कंट्रोल था, जिसमें MAMP को छोड़कर प्रतिक्रिया घोल डाला गया था। प्रत्येक प्लेट में केवल पानी वाले चार खाली कुएं भी शामिल किए गए थे।

अभिक्रिया विलयन डालने के बाद, बायोटेक के सिनर्जी™ 2 मल्टी-डिटेक्शन माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 1 घंटे तक हर 2 मिनट में ल्यूमिनेसेंस का मापन किया गया। प्लेट रीडर इस 1 घंटे के दौरान हर 2 मिनट में ल्यूमिनेसेंस माप लेता है। सभी 31 रीडिंग का योगफल निकालकर प्रत्येक वेल का मान निकाला गया। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए एमएएमपी प्रतिक्रिया का अनुमानित मान (तीनों प्रायोगिक वेल्स के औसत ल्यूमिनेसेंस मान - मॉक वेल मान) - खाली वेल के औसत मान को घटाकर निकाला गया। खाली वेल के मान लगातार शून्य के करीब थे।

पत्ती की डिस्कनिकोटियाना बेंथमियानागुणवत्ता नियंत्रण के उद्देश्य से प्रत्येक 96-वेल प्लेट में नियंत्रण के रूप में एक उच्च प्रतिक्रियाशील ज्वार की किस्म (SC0003) और एक कम प्रतिक्रियाशील ज्वार की किस्म (PI 6069) को भी शामिल किया गया था।

बी. कुकीइनोक्यूलम की तैयारी और इनोक्यूलेशन

बी. कुकीपहले बताए गए तरीके से इनोक्यूलम तैयार किया गया। संक्षेप में, ज्वार के दानों को तीन दिनों तक पानी में भिगोया गया, धोया गया, 1 लीटर के शंक्वाकार फ्लास्क में डाला गया और 15psi और 121 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए ऑटोक्लेव किया गया। इसके बाद दानों में ताजे कल्चर से लगभग 5 मिलीलीटर मैश किए हुए माइसीलिया को डाला गया।बी. कुकीLSLP18 आइसोलेट्स को कमरे के तापमान पर 2 सप्ताह के लिए रखा गया, और हर 3 दिन में फ्लास्क को हिलाया गया। 2 सप्ताह बाद, कवक से संक्रमित ज्वार के दानों को हवा में सुखाया गया और फिर खेत में प्रयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया। पूरे परीक्षण के लिए एक ही इनोक्यूलम का उपयोग किया गया और इसे हर साल ताजा बनाया गया। इनोक्यूलेशन के लिए, 6-10 संक्रमित दानों को 4-5 सप्ताह पुराने ज्वार के पौधों के ऊपरी भाग में रखा गया। इन कवकों से उत्पन्न बीजाणुओं ने एक सप्ताह के भीतर युवा ज्वार के पौधों में संक्रमण शुरू कर दिया।

बीज की तैयारी

खेत में बुवाई से पहले ज्वार के बीजों को फफूंदनाशक, कीटनाशक और बीज सुरक्षा रसायन के मिश्रण से उपचारित किया गया, जिसमें लगभग 1% स्पाइराटो 480 एफएस फफूंदनाशक, 4% सेबरिंग 480 एफएस फफूंदनाशक और 3% सोरप्रो 940 ईएस बीज सुरक्षा रसायन शामिल थे। इसके बाद बीजों को 3 दिनों तक हवा में सुखाया गया, जिससे बीजों के चारों ओर इस मिश्रण की एक पतली परत बन गई। बीज सुरक्षा रसायन की मदद से ड्यूल मैग्नम खरपतवारनाशक का उपयोग अंकुरण-पूर्व उपचार के रूप में किया जा सका।

लक्षित पत्ती धब्बा प्रतिरोध का मूल्यांकन

एससीपी (SCP) को 14-15 जून, 2017 और 20 जून, 2018 को उत्तरी कैरोलिना के क्लेटन स्थित केंद्रीय फसल अनुसंधान केंद्र में यादृच्छिक पूर्ण ब्लॉक डिज़ाइन में बोया गया था, जिसमें प्रत्येक प्रयोग में दो प्रतिकृतियां थीं। प्रयोगों को 1.8 मीटर लंबी एकल पंक्तियों में 0.9 मीटर की पंक्ति चौड़ाई के साथ प्रति प्लॉट 10 बीजों का उपयोग करके बोया गया था। किनारे के प्रभावों को रोकने के लिए प्रत्येक प्रयोग की परिधि के चारों ओर दो सीमावर्ती पंक्तियाँ बोई गईं। प्रयोगों को 20 जुलाई, 2017 और 20 जुलाई, 2018 को इनोक्यूलेट किया गया था, उस समय ज्वार के पौधे विकास के तीसरे चरण में थे। रेटिंग एक से नौ के पैमाने पर ली गई थी, जिसमें रोग के कोई लक्षण न दिखाने वाले पौधों को नौ अंक और पूरी तरह से मृत पौधों को एक अंक दिया गया था। 2017 में दो रेटिंग और 2018 में चार रीडिंग ली गईं, जो प्रत्येक वर्ष इनोक्यूलेशन के दो सप्ताह बाद शुरू हुईं। sAUDPC (रोग प्रगति वक्र के अंतर्गत मानकीकृत क्षेत्र) की गणना पहले बताए गए तरीके से की गई थी।