कवकनाशी अनुपूरण एकान्त मेसन मधुमक्खियों में शुद्ध ऊर्जा लाभ और माइक्रोबायोम विविधता को कम करता है।

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कवकनाशी का उपयोग अक्सर पेड़ के फल फूलने के दौरान किया जाता है और इससे परागण करने वाले कीटों को खतरा हो सकता है।हालाँकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी है कि गैर-मधुमक्खी परागणकर्ता (उदाहरण के लिए, एकान्त मधुमक्खियाँ, ऑस्मिया कॉर्निफ्रॉन) फूलों के दौरान सेब पर आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशी पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं।यह ज्ञान अंतर सुरक्षित सांद्रता और कवकनाशी छिड़काव के समय को निर्धारित करने वाले नियामक निर्णयों को सीमित करता है।हमने दो संपर्क कवकनाशी (कैप्टन और मैनकोज़ेब) और चार इंटरलेयर/फाइटोसिस्टम कवकनाशी (सिप्रोसाइक्लिन, मायक्लोबुटानिल, पायरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) के प्रभावों का आकलन किया।लार्वा के वजन में वृद्धि, उत्तरजीविता, लिंगानुपात और जीवाणु विविधता पर प्रभाव।मूल्यांकन एक क्रोनिक मौखिक बायोएसे का उपयोग करके आयोजित किया गया था जिसमें पराग का उपचार क्षेत्र में उपयोग के लिए वर्तमान में अनुशंसित खुराक (1X), आधी खुराक (0.5X) और कम खुराक (0.1X) के आधार पर तीन खुराक में किया गया था।मैन्कोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की सभी खुराकों ने शरीर के वजन और लार्वा के अस्तित्व को काफी कम कर दिया।फिर हमने उच्चतम मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार कवकनाशी, मैन्कोज़ेब के लार्वा जीवाणु को चिह्नित करने के लिए 16 एस जीन को अनुक्रमित किया।हमने पाया कि मैन्कोजेब-उपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा में बैक्टीरिया की विविधता और बहुतायत में काफी कमी आई थी।हमारी प्रयोगशाला के नतीजे बताते हैं कि फूल आने के दौरान इनमें से कुछ कवकनाशी का छिड़काव विशेष रूप से ओ. कॉर्निफ्रोन्स के स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है।यह जानकारी फलों के पेड़ संरक्षण उत्पादों के स्थायी उपयोग के संबंध में भविष्य के प्रबंधन निर्णयों के लिए प्रासंगिक है और परागणकों की सुरक्षा के उद्देश्य से नियामक प्रक्रियाओं के आधार के रूप में कार्य करती है।
एकान्त राजमिस्त्री मधुमक्खी ऑस्मिया कॉर्निफ्रोन्स (हाइमनोप्टेरा: मेगाचिलिडे) को 1970 के दशक के अंत और 1980 के दशक की शुरुआत में जापान से संयुक्त राज्य अमेरिका में लाया गया था, और इस प्रजाति ने तब से प्रबंधित पारिस्थितिक तंत्र में एक महत्वपूर्ण परागणकर्ता की भूमिका निभाई है।इस मधुमक्खी की प्राकृतिक आबादी जंगली मधुमक्खियों की लगभग 50 प्रजातियों का हिस्सा है जो संयुक्त राज्य अमेरिका2,3 में बादाम और सेब के बगीचों को परागित करने वाली मधुमक्खियों की पूरक हैं।मेसन मधुमक्खियों को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जिनमें निवास स्थान का विखंडन, रोगजनक और कीटनाशक3,4 शामिल हैं।कीटनाशकों के बीच, कवकनाशी ऊर्जा लाभ, चारा 5 और शरीर कंडीशनिंग 6,7 को कम करते हैं।हालाँकि हाल के शोध से पता चलता है कि मेसन मधुमक्खियों का स्वास्थ्य सीधे तौर पर कमेंसल और एक्टोबैक्टीक सूक्ष्मजीवों से प्रभावित होता है, 8,9 क्योंकि बैक्टीरिया और कवक पोषण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, मेसन मधुमक्खियों की माइक्रोबियल विविधता पर कवकनाशी के संपर्क का प्रभाव अभी शुरू हो रहा है। अध्ययन किया.
सेब की पपड़ी, कड़वा सड़न, भूरा सड़न और पाउडर फफूंदी10,11 जैसी बीमारियों के इलाज के लिए फूल आने से पहले और फूल आने के दौरान बगीचों में विभिन्न प्रभावों (संपर्क और प्रणालीगत) के कवकनाशी का छिड़काव किया जाता है।फफूंदनाशकों को परागणकों के लिए हानिरहित माना जाता है, इसलिए फूलों की अवधि के दौरान बागवानों को उनकी सिफारिश की जाती है;मधुमक्खियों द्वारा इन फफूंदनाशकों के संपर्क और अंतर्ग्रहण को अपेक्षाकृत अच्छी तरह से जाना जाता है, क्योंकि यह अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और कई अन्य राष्ट्रीय नियामक एजेंसियों द्वारा कीटनाशक पंजीकरण प्रक्रिया का हिस्सा है।हालाँकि, गैर-मधुमक्खियों पर कवकनाशी के प्रभाव कम ज्ञात हैं क्योंकि संयुक्त राज्य अमेरिका में विपणन प्राधिकरण समझौतों के तहत उनकी आवश्यकता नहीं है।15।इसके अलावा, आमतौर पर एकल मधुमक्खियों के परीक्षण के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं हैं, और परीक्षण के लिए मधुमक्खियों को प्रदान करने वाली कॉलोनियों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है।जंगली मधुमक्खियों पर कीटनाशकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए यूरोप और संयुक्त राज्य अमेरिका में विभिन्न प्रबंधित मधुमक्खियों के परीक्षण तेजी से किए जा रहे हैं, और हाल ही में O. cornifrons19 के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।
सींग वाली मधुमक्खियाँ मोनोसाइट्स होती हैं और व्यावसायिक रूप से कार्प फसलों में शहद मधुमक्खियों के पूरक या प्रतिस्थापन के रूप में उपयोग की जाती हैं।ये मधुमक्खियाँ मार्च और अप्रैल के बीच निकलती हैं, जिनमें असामयिक नर मादाओं से तीन से चार दिन पहले निकलते हैं।संभोग के बाद, मादा ट्यूबलर घोंसले की गुहा (प्राकृतिक या कृत्रिम)1,20 के भीतर ब्रूड कोशिकाओं की एक श्रृंखला प्रदान करने के लिए सक्रिय रूप से पराग और अमृत एकत्र करती है।अंडे कोशिकाओं के अंदर पराग पर रखे जाते हैं;मादा अगली कोशिका तैयार करने से पहले मिट्टी की दीवार बनाती है।पहले इंस्टार लार्वा कोरियोन में घिरे होते हैं और भ्रूण के तरल पदार्थ पर फ़ीड करते हैं।दूसरे से पांचवें इंस्टार (प्रीप्यूपा) तक, लार्वा पराग22 पर फ़ीड करते हैं।एक बार जब पराग की आपूर्ति पूरी तरह से समाप्त हो जाती है, तो लार्वा कोकून बनाते हैं, पुतले बनाते हैं और उसी ब्रूड कक्ष में वयस्कों के रूप में उभरते हैं, आमतौर पर गर्मियों के अंत में20,23।अगले वसंत में वयस्क उभर आते हैं।वयस्क जीवित रहना भोजन सेवन के आधार पर शुद्ध ऊर्जा लाभ (वजन बढ़ना) से जुड़ा हुआ है।इस प्रकार, पराग की पोषण गुणवत्ता, साथ ही मौसम या कीटनाशकों के संपर्क जैसे अन्य कारक, अस्तित्व और स्वास्थ्य24 के निर्धारक हैं।
फूल आने से पहले लगाए गए कीटनाशक और कवकनाशी पौधे के वाहिका के भीतर अलग-अलग डिग्री तक स्थानांतरित होने में सक्षम होते हैं, ट्रांसलैमिनर से (उदाहरण के लिए, कुछ कवकनाशी की तरह पत्तियों की ऊपरी सतह से निचली सतह तक जाने में सक्षम) 25 से लेकर वास्तव में प्रणालीगत प्रभाव तक।, जो जड़ों से मुकुट में प्रवेश कर सकते हैं, सेब के फूलों के रस में प्रवेश कर सकते हैं26, जहां वे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रोन्स27 को मार सकते हैं।कुछ कीटनाशक परागकणों में भी चले जाते हैं, जिससे मक्के के लार्वा का विकास प्रभावित होता है और उनकी मृत्यु हो जाती है19।अन्य अध्ययनों से पता चला है कि कुछ कवकनाशी संबंधित प्रजातियों ओ. लिगनेरिया28 के घोंसले के व्यवहार को महत्वपूर्ण रूप से बदल सकते हैं।इसके अलावा, कीटनाशक जोखिम परिदृश्यों (कवकनाशी सहित) का अनुकरण करने वाले प्रयोगशाला और क्षेत्र अध्ययनों से पता चला है कि कीटनाशक मधुमक्खियों और कुछ एकान्त मधुमक्खियों के शरीर विज्ञान 22 आकृति विज्ञान 29 और अस्तित्व को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं।फूलों के दौरान खुले फूलों पर सीधे लगाए जाने वाले विभिन्न कवकनाशी स्प्रे लार्वा विकास के लिए वयस्कों द्वारा एकत्र किए गए पराग को दूषित कर सकते हैं, जिसके प्रभावों का अध्ययन किया जाना बाकी है30।
यह तेजी से पहचाना जा रहा है कि लार्वा का विकास पाचन तंत्र के पराग और सूक्ष्मजीव समुदायों से प्रभावित होता है।मधुमक्खी माइक्रोबायोम शरीर के द्रव्यमान31, चयापचय परिवर्तन22 और रोगजनकों32 के प्रति संवेदनशीलता जैसे मापदंडों को प्रभावित करता है।पिछले अध्ययनों ने अकेले मधुमक्खियों के माइक्रोबायोम पर विकासात्मक चरण, पोषक तत्वों और पर्यावरण के प्रभाव की जांच की है।इन अध्ययनों से लार्वा और पराग माइक्रोबायोम्स33 की संरचना और प्रचुरता में समानताएं सामने आईं, साथ ही एकल मधुमक्खी प्रजातियों में सबसे आम जीवाणु जेनेरा स्यूडोमोनास और डेल्फ़्टिया भी सामने आए।हालाँकि, हालांकि फफूंदनाशकों को मधुमक्खी के स्वास्थ्य की रक्षा के लिए रणनीतियों के साथ जोड़ा गया है, प्रत्यक्ष मौखिक जोखिम के माध्यम से लार्वा माइक्रोबायोटा पर कवकनाशी के प्रभाव अज्ञात हैं।
इस अध्ययन में संयुक्त राज्य अमेरिका में पेड़ों के फलों पर उपयोग के लिए पंजीकृत छह सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले कवकनाशी की वास्तविक दुनिया की खुराक के प्रभावों का परीक्षण किया गया, जिसमें दूषित भोजन से कॉर्न हॉर्नवॉर्म मोथ लार्वा को मौखिक रूप से प्रशासित संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशी शामिल हैं।हमने पाया कि संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशी ने मधुमक्खी के शरीर के वजन को कम कर दिया और मृत्यु दर में वृद्धि की, जिसमें सबसे गंभीर प्रभाव मैंकोज़ेब और पाइरिथियोपाइड से जुड़े थे।फिर हमने मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग आहार पर खिलाए गए लार्वा की माइक्रोबियल विविधता की तुलना नियंत्रण आहार पर खिलाए गए लार्वा से की।हम मृत्यु दर में अंतर्निहित संभावित तंत्र और एकीकृत कीट और परागणक प्रबंधन (आईपीपीएम)36 कार्यक्रमों के निहितार्थ पर चर्चा करते हैं।
कोकून में सर्दियों में रहने वाले वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन को फल अनुसंधान केंद्र, बिगलेर्विले, पीए से प्राप्त किया गया था, और -3 से 2 डिग्री सेल्सियस (±0.3 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहीत किया गया था।प्रयोग से पहले (कुल 600 कोकून)।मई 2022 में, प्रतिदिन 100 O. कॉर्निफ्रॉन कोकून को प्लास्टिक कप (50 कोकून प्रति कप, DI 5 सेमी × 15 सेमी लंबा) में स्थानांतरित किया गया और खोलने को बढ़ावा देने और चबाने योग्य सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए कप के अंदर वाइप्स रखे गए, जिससे पथरी पर तनाव कम हो गया। मधुमक्खियाँ37 .कोकून वाले दो प्लास्टिक कपों को एक कीट पिंजरे (30 × 30 × 30 सेमी, बगडॉर्म मेगाव्यू साइंस कंपनी लिमिटेड, ताइवान) में 10 मिलीलीटर फीडर के साथ 50% सुक्रोज घोल वाले रखें और बंद करने और संभोग सुनिश्चित करने के लिए चार दिनों के लिए स्टोर करें।23 डिग्री सेल्सियस, सापेक्ष आर्द्रता 60%, प्रकाश अवधि 10 लीटर (कम तीव्रता): 14 दिन।सेब के फूल खिलने के चरम के दौरान 100 संभोगरत मादा और नर को हर सुबह छह दिनों के लिए (प्रति दिन 100) दो कृत्रिम घोंसलों में छोड़ा गया (जाल घोंसला: चौड़ाई 33.66 × ऊंचाई 30.48 × लंबाई 46.99 सेमी; पूरक चित्र 1)।पेंसिल्वेनिया स्टेट आर्बोरेटम में, चेरी के पास (प्रूनस सेरासस 'यूबैंक' स्वीट चेरी पाई™), आड़ू (प्रूनस पर्सिका 'कंटेंडर'), प्रूनस पर्सिका 'पीएफ 27ए' फ्लेमिन फ्यूरी®), नाशपाती (पाइरस पेरीफोलिया 'ओलंपिक', पाइरस) पेरीफोलिया 'शिंको', पाइरस पेरीफोलिया 'शिन्सेइकी'), कोरोनारिया सेब का पेड़ (मालुस कोरोनारिया) और सेब के पेड़ों की कई किस्में (मालुस कोरोनारिया, मालुस), घरेलू सेब का पेड़ 'को-ऑप 30' एंटरप्राइज™, मालुस सेब का पेड़ 'सह- ऑप 31′ वाइनक्रिस्प™, बेगोनिया 'फ्रीडम', बेगोनिया 'गोल्डन डिलीशियस', बेगोनिया 'नोवा स्पाई')।प्रत्येक नीला प्लास्टिक बर्डहाउस दो लकड़ी के बक्सों के ऊपर फिट बैठता है।प्रत्येक नेस्ट बॉक्स में 800 खाली क्राफ्ट पेपर ट्यूब (सर्पिल खुले, 0.8 सेमी आईडी × 15 सेमी एल) (जोन्सविले पेपर ट्यूब कंपनी, मिशिगन) को अपारदर्शी सिलोफ़न ट्यूब (0.7 ओडी देखें प्लास्टिक प्लग (टी -1 एक्स प्लग) नेस्टिंग साइट प्रदान करते हैं) में डाला गया था। .
दोनों घोंसले के बक्से पूर्व की ओर थे और कृंतक और पक्षी की पहुंच को रोकने के लिए हरे प्लास्टिक के बगीचे की बाड़ (एवरबिल्ट मॉडल # 889250ईबी12, उद्घाटन आकार 5 × 5 सेमी, 0.95 मीटर × 100 मीटर) से ढके हुए थे और घोंसले के डिब्बे की मिट्टी के बगल में मिट्टी की सतह पर रखे गए थे। बक्से.नेस्ट बॉक्स (पूरक चित्र 1ए)।घोंसलों से प्रतिदिन 30 ट्यूब इकट्ठा करके और उन्हें प्रयोगशाला में ले जाकर मकई छेदक अंडे एकत्र किए जाते थे।कैंची का उपयोग करके, ट्यूब के अंत में एक कट बनाएं, फिर ब्रूड कोशिकाओं को उजागर करने के लिए सर्पिल ट्यूब को अलग करें।अलग-अलग अंडों और उनके पराग को एक घुमावदार स्पैटुला (माइक्रोस्लाइड टूल किट, बायोक्विप प्रोडक्ट्स इंक, कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके हटा दिया गया था।हमारे प्रयोगों में उपयोग करने से पहले अंडों को नम फिल्टर पेपर पर ऊष्मायन किया गया और 2 घंटे के लिए पेट्री डिश में रखा गया (पूरक चित्र 1 बी-डी)।
प्रयोगशाला में, हमने सेब के फूल खिलने से पहले और उसके दौरान तीन सांद्रता (0.1X, 0.5X, और 1X, जहां 1X प्रति 100 गैलन पानी/एकड़ में लगाया जाने वाला निशान है) पर लागू किए गए छह कवकनाशी की मौखिक विषाक्तता का मूल्यांकन किया। उच्च क्षेत्र की खुराक = एकाग्रता क्षेत्र में)।, तालिका नंबर एक)।प्रत्येक सांद्रता को 16 बार दोहराया गया (n = 16)।दो संपर्क कवकनाशी (तालिका एस1: मैंकोजेब 2696.14 पीपीएम और कैप्टन 2875.88 पीपीएम) और चार प्रणालीगत कवकनाशी (तालिका एस1: पाइरिथियोस्ट्रोबिन 250.14 पीपीएम; ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन 110.06 पीपीएम; मायक्लोबुटानिल एज़ोल 75 .12 पीपीएम; साइप्रोडिनिल 280.845 पीपीएम) फलों, सब्जियों के लिए विषाक्तता और सजावटी फसलें .हमने एक ग्राइंडर का उपयोग करके पराग को समरूप बनाया, 0.20 ग्राम को एक कुएं (24-वेल फाल्कन प्लेट) में स्थानांतरित किया, और 1 मिमी गहरे कुएं के साथ पिरामिड पराग बनाने के लिए कवकनाशी समाधान के 1 μL को मिलाया और मिलाया जिसमें अंडे रखे गए थे।एक मिनी स्पैटुला का उपयोग करके रखें (पूरक चित्र 1सी,डी)।फाल्कन प्लेटों को कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर संग्रहीत किया गया था।हमने उनकी तुलना शुद्ध पानी से उपचारित सजातीय पराग आहार खिलाए गए नियंत्रण लार्वा से की।हमने विश्लेषणात्मक संतुलन (फिशर साइंटिफिक, सटीकता = 0.0001 ग्राम) का उपयोग करके मृत्यु दर दर्ज की और हर दूसरे दिन लार्वा वजन मापा जब तक कि लार्वा प्रीप्यूपल उम्र तक नहीं पहुंच गया।अंततः 2.5 महीने बाद कोकून को खोलकर लिंगानुपात का आकलन किया गया।
डीएनए को पूरे O. कॉर्निफ्रोन्स लार्वा (n = 3 प्रति उपचार स्थिति, मैन्कोजेब-उपचारित और अनुपचारित पराग) से निकाला गया था और हमने इन नमूनों पर माइक्रोबियल विविधता विश्लेषण किया, खासकर क्योंकि मैन्कोजेब में लार्वा में सबसे अधिक मृत्यु दर देखी गई थी।MnZn प्राप्त करना।DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA किट (Zymo रिसर्च, इरविन, CA) का उपयोग करके डीएनए को प्रवर्धित, शुद्ध किया गया और v3 किट का उपयोग करके Illumina® MiSeq™ पर अनुक्रमित (600 चक्र) किया गया।16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को लक्षित करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके क्विक-16S™ NGS लाइब्रेरी प्रेप किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, CA) का उपयोग करके बैक्टीरिया 16S राइबोसोमल RNA जीन का लक्षित अनुक्रमण किया गया था।इसके अतिरिक्त, 10% PhiX समावेशन का उपयोग करके 18S अनुक्रमण किया गया था, और प्राइमर जोड़ी 18S001 और NS4 का उपयोग करके प्रवर्धन किया गया था।
QIIME2 पाइपलाइन (v2022.11.1) का उपयोग करके युग्मित रीड्स39 को आयात और प्रोसेस करें।इन रीड्स को ट्रिम और मर्ज किया गया था, और QIIME2 (qiime dada2 नॉइज़ पेयरिंग)40 में DADA2 प्लगइन का उपयोग करके काइमेरिक अनुक्रमों को हटा दिया गया था।16एस और 18एस क्लास असाइनमेंट ऑब्जेक्ट क्लासिफायर प्लगइन क्लासीफाई-स्केलर्न और पूर्व-प्रशिक्षित आर्टिफैक्ट सिल्वा-138-99-एनबी-क्लासिफायर का उपयोग करके किए गए थे।
सभी प्रायोगिक डेटा को सामान्यता (शापिरो-विल्क्स) और भिन्नताओं की एकरूपता (लेवेने परीक्षण) के लिए जांचा गया।क्योंकि डेटा सेट पैरामीट्रिक विश्लेषण की मान्यताओं को पूरा नहीं करता था और परिवर्तन अवशेषों को मानकीकृत करने में विफल रहा, हमने दो कारकों [समय (तीन-चरण 2, 5, और 8 दिन) के साथ एक गैर-पैरामीट्रिक दो-तरफा एनोवा (क्रुस्कल-वालिस) का प्रदर्शन किया। समय बिंदु) और कवकनाशी] लार्वा ताजा वजन पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, फिर विलकॉक्सन परीक्षण का उपयोग करके पोस्ट हॉक नॉनपैरामेट्रिक जोड़ीवार तुलना की गई।हमने तीन कवकनाशी सांद्रताओं में जीवित रहने पर कवकनाशी के प्रभावों की तुलना करने के लिए पॉइसन वितरण के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (जीएलएम) का उपयोग किया।विभेदक बहुतायत विश्लेषण के लिए, एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (एएसवी) की संख्या को जीनस स्तर पर ढहा दिया गया था।16S (जीनस स्तर) और 18S सापेक्ष बहुतायत का उपयोग करने वाले समूहों के बीच अंतर बहुतायत की तुलना बीटा शून्य-फुलाए गए (BEZI) परिवार वितरण के साथ स्थिति, पैमाने और आकार (GAMLSS) के लिए एक सामान्यीकृत योजक मॉडल का उपयोग करके की गई थी, जो एक मैक्रो पर मॉडलिंग की गई थी। .माइक्रोबायोम R43 (v1.1) में।1).विभेदक विश्लेषण से पहले माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट प्रजातियों को हटा दें।18S के विभिन्न वर्गीकरण स्तरों के कारण, अंतर विश्लेषण के लिए प्रत्येक वर्गीकरण के केवल निम्नतम स्तर का उपयोग किया गया था।सभी सांख्यिकीय विश्लेषण आर (v. 3.4.3., सीआरएएन प्रोजेक्ट) (टीम 2013) का उपयोग करके किए गए थे।
मैन्कोजेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन के संपर्क से ओ. कॉर्निफ्रोन्स में शरीर का वजन बढ़ना काफी कम हो गया (चित्र 1)।ये प्रभाव मूल्यांकन की गई सभी तीन खुराकों के लिए लगातार देखे गए (चित्र 1ए-सी)।साइक्लोस्ट्रोबिन और मायक्लोबुटानिल ने लार्वा के वजन को उल्लेखनीय रूप से कम नहीं किया।
तना छेदक लार्वा का औसत ताजा वजन चार आहार उपचार (सजातीय पराग फ़ीड + कवकनाशी: नियंत्रण, 0.1X, 0.5X और 1X खुराक) के तहत तीन समय बिंदुओं पर मापा जाता है।(ए) कम खुराक (0.1एक्स): पहली बार बिंदु (दिन 1): χ2: 30.99, डीएफ = 6;पी <0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): 22.83, डीएफ = 0.0009;तीसरी बार;बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, डीएफ = 6;(बी) आधी खुराक (0.5X): पहली बार बिंदु (दिन 1): χ2: 35.67, डीएफ = 6;पी <0.0001, दूसरा समय बिंदु (पहला दिन)।): χ2: 15.98, डीएफ = 6;पी = 0.0090;तीसरा समय बिंदु (दिन 8) χ2: 16.47, डीएफ = 6;(सी) साइट या पूर्ण खुराक (1एक्स): पहली बार बिंदु (दिन 1) χ2: 20.64, पी = 6;पी = 0.0326, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): χ2: 22.83, डीएफ = 6;पी = 0.0009;तीसरा समय बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, डीएफ = 6;विचरण का गैर-पैरामीट्रिक विश्लेषण।बार्स जोड़ीवार तुलनाओं के माध्य ± SE का प्रतिनिधित्व करते हैं (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001।
सबसे कम खुराक (0.1X) पर, लार्वा के शरीर का वजन ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के साथ 60%, मैन्कोजेब के साथ 49%, मायक्लोबुटानिल के साथ 48% और पाइरिथिस्ट्रोबिन के साथ 46% कम हो गया था (चित्र 1 ए)।आधी फ़ील्ड खुराक (0.5X) के संपर्क में आने पर, मैन्कोज़ेब लार्वा का शरीर का वजन 86%, पाइरिथियोस्ट्रोबिन 52% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन 50% कम हो गया (चित्र 1 बी)।मैन्कोज़ेब की एक पूर्ण फ़ील्ड खुराक (1X) ने लार्वा के वजन को 82%, पाइरिथियोस्ट्रोबिन को 70% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन, मायक्लोबुटानिल और सेंगर्ड को लगभग 30% कम कर दिया (चित्र 1 सी)।
मैन्कोजेब-उपचारित पराग से पोषित लार्वा में मृत्यु दर सबसे अधिक थी, इसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन थे।मैन्कोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की बढ़ती खुराक के साथ मृत्यु दर में वृद्धि हुई (चित्र 2; तालिका 2)।हालाँकि, ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन सांद्रता में वृद्धि के कारण मकई छेदक की मृत्यु दर में थोड़ी वृद्धि हुई;नियंत्रण उपचारों की तुलना में साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने मृत्यु दर में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं की।
छह अलग-अलग कवकनाशी के साथ व्यक्तिगत रूप से उपचारित पराग के अंतर्ग्रहण के बाद बोरर मक्खी के लार्वा की मृत्यु दर की तुलना की गई।मैन्कोज़ेब और पेंटोपाइरामाइड मकई के कीड़ों के मौखिक संपर्क के प्रति अधिक संवेदनशील थे (जीएलएम: χ = 29.45, डीएफ = 20, पी = 0.0059) (रेखा, ढलान = 0.29, पी <0.001; ढलान = 0.24, पी <0.00))।
औसतन, सभी उपचारों में, 39.05% मरीज़ महिलाएँ थीं और 60.95% पुरुष थे।नियंत्रण उपचारों में, कम खुराक (0.1X) और आधी खुराक (0.5X) दोनों अध्ययनों में महिलाओं का अनुपात 40% था, और फ़ील्ड-खुराक (1X) अध्ययनों में 30% था।0.1X खुराक पर, मैन्कोज़ेब और मायक्लोबुटानिल से उपचारित पराग-पोषित लार्वा में, 33.33% वयस्क मादा थे, 22% वयस्क मादा थे, 44% वयस्क लार्वा मादा थे, 44% वयस्क लार्वा मादा थे।मादा, 41% वयस्क लार्वा मादाएं थीं, और नियंत्रण 31% थे (चित्र 3ए)।0.5 गुना खुराक पर, मैन्कोज़ेब और पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 33% वयस्क कीड़े मादा थे, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 36%, मायक्लोबुटानिल समूह में 41% और साइप्रोस्ट्रोबिन समूह में 46% थे।समूह में यह आंकड़ा 53% था.कैप्टन समूह में और नियंत्रण समूह में 38% (चित्र 3बी)।1X खुराक पर, मैन्कोज़ेब समूह की 30% महिलाएं थीं, पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह की 36%, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह की 44%, मायक्लोबुटानिल समूह की 38%, नियंत्रण समूह की 50% महिलाएं थीं - 38.5% (छवि 3 सी) .
लार्वा चरण कवकनाशी के संपर्क के बाद मादा और नर बेधक का प्रतिशत।(ए) कम खुराक (0.1X)।(बी) आधी खुराक (0.5X)।(सी) फ़ील्ड खुराक या पूर्ण खुराक (1एक्स)।
16एस अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि बैक्टीरिया समूह मैन्कोजेब-उपचारित पराग से पोषित लार्वा और अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा के बीच भिन्न था (चित्र 4 ए)।पराग पर खिलाए गए अनुपचारित लार्वा का माइक्रोबियल सूचकांक मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक था (चित्र 4 बी)।यद्यपि समूहों के बीच समृद्धि में देखा गया अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, यह अनुपचारित पराग पर लार्वा खिलाने के लिए देखे गए अंतर से काफी कम था (छवि 4 सी)।सापेक्ष बहुतायत से पता चला कि नियंत्रण पराग पर खिलाए गए लार्वा का माइक्रोबायोटा मैनकोज़ेब-उपचारित लार्वा (छवि 5 ए) पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक विविध था।वर्णनात्मक विश्लेषण से नियंत्रण और मैन्कोज़ेब-उपचारित नमूनों में 28 प्रजातियों की उपस्थिति का पता चला (चित्र 5 बी)।सी 18एस अनुक्रमण का उपयोग करके विश्लेषण से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पता चला (पूरक चित्र 2)।
16एस अनुक्रमों पर आधारित एसएवी प्रोफाइल की तुलना शैनन समृद्धि के साथ की गई और फ़ाइलम स्तर पर समृद्धि देखी गई।(ए) अनुपचारित पराग-पोषित या नियंत्रण (नीला) और मैन्कोज़ेब-पोषित लार्वा (नारंगी) में समग्र माइक्रोबियल समुदाय संरचना पर आधारित प्रधान समन्वय विश्लेषण (पीसीओए)।प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग नमूने का प्रतिनिधित्व करता है।पीसीओए की गणना बहुभिन्नरूपी टी वितरण की ब्रे-कर्टिस दूरी का उपयोग करके की गई थी।अंडाकार 80% आत्मविश्वास स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं।(बी) बॉक्सप्लॉट, कच्चा शैनन धन डेटा (अंक) और सी।देखने योग्य धन.बॉक्सप्लॉट मध्य रेखा, इंटरक्वेर्टाइल रेंज (आईक्यूआर), और 1.5 × आईक्यूआर (एन = 3) के लिए बॉक्स दिखाते हैं।
मैन्कोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा के माइक्रोबियल समुदायों की संरचना।(ए) लार्वा में माइक्रोबियल जेनेरा की सापेक्ष बहुतायत पढ़ी जाती है।(बी) पहचाने गए सूक्ष्मजीव समुदायों का हीट मैप।डेल्फ़्टिया (विषम अनुपात (OR) = 0.67, P = 0.0030) और स्यूडोमोनास (OR = 0.3, P = 0.0074), माइक्रोबैक्टीरियम (OR = 0.75, P = 0.0617) (OR = 1.5, P = 0.0060);सहसंबंध दूरी और औसत कनेक्टिविटी का उपयोग करके हीट मैप पंक्तियों को क्लस्टर किया जाता है।
हमारे परिणाम बताते हैं कि संपर्क (मैन्कोज़ेब) और प्रणालीगत (पाइरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) कवकनाशी के मौखिक संपर्क से, जो फूलों के दौरान व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, वजन में काफी कमी आई है और मक्के के लार्वा की मृत्यु दर में वृद्धि हुई है।इसके अलावा, मैन्कोज़ेब ने प्रीप्यूपल चरण के दौरान माइक्रोबायोम की विविधता और समृद्धि को काफी कम कर दिया।माइक्लोबुटानिल, एक अन्य प्रणालीगत कवकनाशी, ने तीनों खुराकों में लार्वा के शरीर के वजन में उल्लेखनीय वृद्धि को कम कर दिया।यह प्रभाव दूसरे (दिन 5) और तीसरे (दिन 8) समय बिंदुओं पर स्पष्ट था।इसके विपरीत, साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण समूह की तुलना में वजन बढ़ने या जीवित रहने में उल्लेखनीय कमी नहीं की।हमारी जानकारी के अनुसार, यह कार्य प्रत्यक्ष पराग संपर्क के माध्यम से मकई की फसलों की रक्षा के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न कवकनाशी के क्षेत्र दरों के प्रभावों को निर्धारित करने वाला पहला है।
सभी कवकनाशी उपचारों ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में शरीर के वजन में उल्लेखनीय वृद्धि को कम कर दिया।मैंकोज़ेब का लार्वा के शरीर के वजन में वृद्धि पर सबसे अधिक प्रभाव पड़ा, जिसमें औसतन 51% की कमी आई, इसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन का स्थान रहा।हालाँकि, अन्य अध्ययनों ने लार्वा चरणों44 पर कवकनाशी की फ़ील्ड खुराक के प्रतिकूल प्रभाव की सूचना नहीं दी है।हालाँकि डाइथियोकार्बामेट बायोसाइड्स में तीव्र विषाक्तता कम देखी गई है, एथिलीन बिस्डिथियोकार्बामेट्स (ईबीडीसीएस) जैसे मैन्कोज़ेब यूरिया एथिलीन सल्फाइड में विघटित हो सकता है।अन्य जानवरों में इसके उत्परिवर्ती प्रभावों को देखते हुए, यह क्षरण उत्पाद देखे गए प्रभावों46,47 के लिए जिम्मेदार हो सकता है।पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एथिलीन थियोरिया का निर्माण ऊंचे तापमान48, आर्द्रता स्तर49 और उत्पाद भंडारण की लंबाई50 जैसे कारकों से प्रभावित होता है।बायोसाइड्स के लिए उचित भंडारण की स्थिति इन दुष्प्रभावों को कम कर सकती है।इसके अलावा, यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण ने पाइरिथियोपाइड की विषाक्तता के बारे में चिंता व्यक्त की है, जिसे अन्य जानवरों के पाचन तंत्र51 के लिए कैंसरकारी दिखाया गया है।
मैन्कोजेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन के मौखिक प्रशासन से मकई छेदक लार्वा की मृत्यु दर बढ़ जाती है।इसके विपरीत, मायक्लोबुटानिल, सिप्रोसाइक्लिन और कैप्टन का मृत्यु दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।ये परिणाम लैडर्नर एट अल.52 से भिन्न हैं, जिन्होंने दिखाया कि कैप्टन ने वयस्क ओ. लिग्नेरिया और एपिस मेलिफेरा एल. (हाइमेनोप्टेरा, एपिसिडे) के अस्तित्व को काफी कम कर दिया है।इसके अलावा, कैप्टान और बोस्कालिड जैसे फफूंदनाशकों को लार्वा मृत्यु दर52,53,54 या भोजन व्यवहार में बदलाव का कारण पाया गया है।ये परिवर्तन, बदले में, पराग की पोषण गुणवत्ता और अंततः लार्वा चरण के ऊर्जा लाभ को प्रभावित कर सकते हैं।नियंत्रण समूह में देखी गई मृत्यु दर अन्य अध्ययनों 56,57 के अनुरूप थी।
हमारे काम में देखे गए पुरुष-अनुकूल लिंग अनुपात को फूलों के दौरान अपर्याप्त संभोग और खराब मौसम की स्थिति जैसे कारकों द्वारा समझाया जा सकता है, जैसा कि पहले विसेंस और बॉश द्वारा ओ. कॉर्नुटा के लिए सुझाव दिया गया था।हालाँकि हमारे अध्ययन में महिलाओं और पुरुषों के पास संभोग के लिए चार दिन थे (एक अवधि जिसे आम तौर पर सफल संभोग के लिए पर्याप्त माना जाता है), हमने तनाव को कम करने के लिए जानबूझकर प्रकाश की तीव्रता कम कर दी।हालाँकि, यह संशोधन अनजाने में संभोग प्रक्रिया61 में हस्तक्षेप कर सकता है।इसके अलावा, मधुमक्खियां कई दिनों तक प्रतिकूल मौसम का अनुभव करती हैं, जिसमें बारिश और कम तापमान (<5°C) शामिल हैं, जो संभोग की सफलता4,23 पर भी नकारात्मक प्रभाव डाल सकता है।
यद्यपि हमारा अध्ययन संपूर्ण लार्वा माइक्रोबायोम पर केंद्रित है, हमारे परिणाम जीवाणु समुदायों के बीच संभावित संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो मधुमक्खी के पोषण और कवकनाशी जोखिम के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं।उदाहरण के लिए, लार्वा खिलाए गए मैन्कोजेब-उपचारित पराग ने लार्वा खिलाए गए अनुपचारित पराग की तुलना में माइक्रोबियल समुदाय संरचना और बहुतायत को काफी कम कर दिया था।अनुपचारित पराग का उपभोग करने वाले लार्वा में, जीवाणु समूह प्रोटीओबैक्टीरिया और एक्टिनोबैक्टीरिया प्रमुख थे और मुख्य रूप से एरोबिक या ऐच्छिक रूप से एरोबिक थे।डेल्फ़्ट बैक्टीरिया, जो आमतौर पर अकेली मधुमक्खी प्रजातियों से जुड़े होते हैं, उनमें एंटीबायोटिक गतिविधि होती है, जो रोगजनकों के खिलाफ संभावित सुरक्षात्मक भूमिका का संकेत देती है।एक अन्य जीवाणु प्रजाति, स्यूडोमोनास, अनुपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में प्रचुर मात्रा में थी, लेकिन मैन्कोज़ेब-उपचारित लार्वा में काफी कम हो गई थी।हमारे परिणाम पिछले अध्ययनों का समर्थन करते हैं जो स्यूडोमोनास को ओ. बाइकोर्निस35 और अन्य एकान्त ततैया34 में सबसे प्रचुर प्रजातियों में से एक के रूप में पहचानते हैं।यद्यपि O. कॉर्निफ्रोन्स के स्वास्थ्य में स्यूडोमोनास की भूमिका के प्रायोगिक साक्ष्य का अध्ययन नहीं किया गया है, यह जीवाणु बीटल पेडेरस फ्यूसिप्स में सुरक्षात्मक विषाक्त पदार्थों के संश्लेषण को बढ़ावा देने और इन विट्रो 35, 65 में आर्गिनिन चयापचय को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। ये अवलोकन सुझाव देते हैं ओ. कॉर्निफ्रोन्स लार्वा के विकास के समय वायरल और बैक्टीरियल रक्षा में एक संभावित भूमिका।माइक्रोबैक्टीरियम हमारे अध्ययन में पहचानी गई एक अन्य प्रजाति है जिसके बारे में बताया गया है कि यह भुखमरी की स्थिति में ब्लैक सोल्जर फ्लाई लार्वा में बड़ी संख्या में मौजूद है।O. कॉर्निफ़्रोन्स लार्वा में, माइक्रोबैक्टीरिया तनाव की स्थिति में आंत माइक्रोबायोम के संतुलन और लचीलेपन में योगदान कर सकते हैं।इसके अतिरिक्त, रोडोकोकस ओ. कॉर्निफ्रोन्स लार्वा में पाया जाता है और अपनी विषहरण क्षमताओं67 के लिए जाना जाता है।यह जीन ए. फ्लोरिया की आंत में भी पाया जाता है, लेकिन बहुत कम बहुतायत में68।हमारे परिणाम कई माइक्रोबियल टैक्सा में कई आनुवंशिक विविधताओं की उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं जो लार्वा में चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं।हालाँकि, O. कॉर्निफ्रोन्स की कार्यात्मक विविधता की बेहतर समझ की आवश्यकता है।
संक्षेप में, परिणाम बताते हैं कि मैन्कोजेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन ने शरीर के वजन में वृद्धि को कम कर दिया और मकई बोरर लार्वा की मृत्यु दर में वृद्धि की।यद्यपि परागणकों पर कवकनाशी के प्रभाव के बारे में चिंता बढ़ रही है, लेकिन इन यौगिकों के अवशिष्ट मेटाबोलाइट्स के प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता है।इन परिणामों को एकीकृत परागण प्रबंधन कार्यक्रमों के लिए सिफारिशों में शामिल किया जा सकता है जो किसानों को कवकनाशी का चयन करके और आवेदन के समय को अलग करके, या कम हानिकारक विकल्पों के उपयोग को प्रोत्साहित करके फलों के पेड़ के फूल के पहले और दौरान कुछ कवकनाशी के उपयोग से बचने में मदद करते हैं। 36. यह जानकारी सिफ़ारिशें विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।कीटनाशकों के उपयोग पर, जैसे मौजूदा स्प्रे कार्यक्रमों को समायोजित करना और फफूंदनाशकों का चयन करते समय स्प्रे का समय बदलना या कम खतरनाक विकल्पों के उपयोग को बढ़ावा देना।लिंगानुपात, भोजन व्यवहार, आंत माइक्रोबायोम और मकई बोरर वजन घटाने और मृत्यु दर के अंतर्निहित आणविक तंत्र पर कवकनाशी के प्रतिकूल प्रभावों पर और अधिक शोध की आवश्यकता है।
चित्र 1 और 2 में स्रोत डेटा 1, 2 और 3 को फिगशेयर डेटा रिपॉजिटरी DOI में जमा किया गया है: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 और https://doi.org/10.6084/m9।अंजीरशेयर.24996233.वर्तमान अध्ययन में विश्लेषण किए गए अनुक्रम (चित्र 4, 5) परिग्रहण संख्या PRJNA1023565 के तहत एनसीबीआई एसआरए भंडार में उपलब्ध हैं।
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