कवकनाशी अनुपूरण से अकेले रहने वाली मधुमक्खियों में शुद्ध ऊर्जा लाभ और माइक्रोबायोम विविधता कम हो जाती है।

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फफूंदनाशकों का इस्तेमाल अक्सर पेड़ों के फलों के फूलने के दौरान किया जाता है और इससे कीट परागणकों को खतरा हो सकता है। हालांकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी है कि गैर-मधुमक्खी परागणकर्ता (जैसे, अकेली मधुमक्खियां, ओस्मिया कॉर्निफ्रॉन) फूल आने के दौरान सेब पर आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले संपर्क और प्रणालीगत फफूंदनाशकों पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं। यह ज्ञान अंतर फफूंदनाशक छिड़काव की सुरक्षित सांद्रता और समय निर्धारित करने वाले नियामक निर्णयों को सीमित करता है। हमने दो संपर्क फफूंदनाशकों (कैप्टन और मैन्कोज़ेब) और चार इंटरलेयर/फाइटोसिस्टम फफूंदनाशकों (सिप्रोसाइक्लिन, माइक्लोबुटानिल, पायरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) के प्रभावों का आकलन किया। लार्वा के वजन में वृद्धि, जीवित रहने, लिंग अनुपात और जीवाणु विविधता पर प्रभाव। मूल्यांकन एक पुरानी मौखिक जैव परख का उपयोग करके किया गया था जिसमें पराग को वर्तमान में क्षेत्र उपयोग (1X), आधी खुराक (0.5X) और कम खुराक (0.1X) के लिए अनुशंसित खुराक के आधार पर तीन खुराक में उपचारित किया गया था। मैन्कोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की सभी खुराकों ने शरीर के वजन और लार्वा के जीवित रहने को काफी कम कर दिया। फिर हमने उच्चतम मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार कवकनाशी मैन्कोज़ेब के लार्वा जीवाणुओं की विशेषता के लिए 16S जीन का अनुक्रम किया। हमने पाया कि मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा में जीवाणुओं की विविधता और प्रचुरता काफी कम हो गई थी। हमारे प्रयोगशाला परिणामों से संकेत मिलता है कि फूल आने के दौरान इनमें से कुछ कवकनाशियों का छिड़काव विशेष रूप से ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है। यह जानकारी फलों के पेड़ों की सुरक्षा उत्पादों के सतत उपयोग के बारे में भविष्य के प्रबंधन निर्णयों के लिए प्रासंगिक है और परागणकों की सुरक्षा के उद्देश्य से नियामक प्रक्रियाओं के आधार के रूप में कार्य करती है।
एकाकी मेसन मधुमक्खी ओस्मिया कॉर्निफ्रॉन्स (हाइमेनोप्टेरा: मेगाचिलिडे) को 1970 के दशक के अंत और 1980 के दशक की शुरुआत में जापान से संयुक्त राज्य अमेरिका में लाया गया था, और तब से इस प्रजाति ने प्रबंधित पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण परागणकर्ता की भूमिका निभाई है। इस मधुमक्खी की प्राकृतिक आबादी जंगली मधुमक्खियों की लगभग 50 प्रजातियों का हिस्सा है जो संयुक्त राज्य अमेरिका में बादाम और सेब के बागों में परागण करने वाली मधुमक्खियों की पूरक हैं2,3। मेसन मधुमक्खियों को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जिसमें आवास विखंडन, रोगजनक और कीटनाशक3,4 शामिल हैं। कीटनाशकों में, कवकनाशी ऊर्जा लाभ, चारा5 और शरीर की कंडीशनिंग6,7 को कम करते हैं। हालाँकि हाल के शोध से पता चलता है कि मेसन मधुमक्खियों का स्वास्थ्य सीधे तौर पर सहभोजी और एक्टोबैक्टिक सूक्ष्मजीवों से प्रभावित होता है, 8,9 क्योंकि बैक्टीरिया और कवक पोषण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, मेसन मधुमक्खियों की सूक्ष्मजीव विविधता पर कवकनाशी के संपर्क के प्रभावों का अध्ययन अभी शुरू हुआ है।
विभिन्न प्रभावों (संपर्क और प्रणालीगत) के कवकनाशकों को सेब की पपड़ी, कड़वा सड़ांध, भूरे रंग की सड़ांध और पाउडरी फफूंदी10,11 जैसी बीमारियों के इलाज के लिए फूलों से पहले और उसके दौरान बगीचों में छिड़का जाता है। कवकनाशकों को परागणकों के लिए हानिरहित माना जाता है, इसलिए उन्हें फूलों की अवधि के दौरान बागवानों को अनुशंसित किया जाता है; मधुमक्खियों द्वारा इन कवकनाशकों के संपर्क और अंतर्ग्रहण के बारे में अपेक्षाकृत अच्छी तरह से जाना जाता है, क्योंकि यह अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और कई अन्य राष्ट्रीय नियामक एजेंसियों12,13,14 द्वारा कीटनाशक पंजीकरण प्रक्रिया का हिस्सा है। हालांकि, गैर-मधुमक्खियों पर कवकनाशकों के प्रभाव कम ज्ञात हैं क्योंकि वे संयुक्त राज्य अमेरिका में विपणन प्राधिकरण समझौतों के तहत आवश्यक नहीं हैं15। इसके अलावा, आम तौर पर एकल मधुमक्खियों के परीक्षण के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं हैं16,17, और परीक्षण के लिए मधुमक्खियों को प्रदान करने वाली कॉलोनियों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है18। जंगली मधुमक्खियों पर कीटनाशकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए यूरोप और यूएसए में विभिन्न प्रबंधित मधुमक्खियों के परीक्षण तेजी से किए जा रहे हैं, और हाल ही में ओ. कॉर्निफ्रॉन्स19 के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।
सींग वाली मधुमक्खियाँ मोनोसाइट्स होती हैं और इन्हें व्यावसायिक रूप से कार्प फसलों में शहद की मक्खियों के पूरक या प्रतिस्थापन के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। ये मधुमक्खियाँ मार्च और अप्रैल के बीच निकलती हैं, जिनमें मादाओं से तीन से चार दिन पहले ही नर निकलते हैं। संभोग के बाद, मादा सक्रिय रूप से पराग और अमृत एकत्र करती है ताकि ट्यूबलर घोंसले की गुहा (प्राकृतिक या कृत्रिम) के भीतर ब्रूड कोशिकाओं की एक श्रृंखला प्रदान की जा सके1,20। कोशिकाओं के अंदर पराग पर अंडे दिए जाते हैं; मादा फिर अगली कोशिका तैयार करने से पहले मिट्टी की दीवार बनाती है। पहले इंस्टार लार्वा कोरियोन में बंद होते हैं और भ्रूण के तरल पदार्थ पर भोजन करते हैं। दूसरे से पांचवें इंस्टार (प्रीप्यूपा) तक, लार्वा पराग पर भोजन करते हैं22। एक बार जब पराग की आपूर्ति पूरी तरह से समाप्त हो जाती है, तो लार्वा कोकून बनाते हैं, प्यूपा बनाते हैं और उसी ब्रूड चैंबर में वयस्क के रूप में निकलते हैं, आमतौर पर गर्मियों के अंत में20,23। वयस्क अगले वसंत में निकलते हैं। वयस्क का जीवित रहना भोजन के सेवन के आधार पर शुद्ध ऊर्जा लाभ (वजन में वृद्धि) से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, पराग की पोषण गुणवत्ता, साथ ही मौसम या कीटनाशकों के संपर्क जैसे अन्य कारक, अस्तित्व और स्वास्थ्य के निर्धारक हैं24।
फूल आने से पहले डाले गए कीटनाशक और कवकनाशक पौधे की रक्त वाहिकाओं के भीतर अलग-अलग डिग्री तक स्थानांतरित करने में सक्षम होते हैं, ट्रांसलेमिनर (उदाहरण के लिए, कुछ कवकनाशकों की तरह पत्तियों की ऊपरी सतह से निचली सतह पर जाने में सक्षम) 25 से लेकर वास्तव में प्रणालीगत प्रभावों तक। , जो जड़ों से मुकुट में प्रवेश कर सकते हैं, सेब के फूलों के रस में प्रवेश कर सकते हैं26, जहां वे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन्स27 को मार सकते हैं। कुछ कीटनाशक पराग में भी घुल जाते हैं, मक्का के लार्वा के विकास को प्रभावित करते हैं और उनकी मृत्यु का कारण बनते हैं19। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि कुछ कवकनाशक संबंधित प्रजातियों ओ. लिग्नेरिया28 के घोंसले के शिकार व्यवहार को महत्वपूर्ण रूप से बदल सकते हैं। फूल खिलने के दौरान खुले फूलों पर सीधे छिड़के जाने वाले विभिन्न कवकनाशक स्प्रे, लार्वा विकास के लिए वयस्कों द्वारा एकत्रित पराग को दूषित कर सकते हैं, जिसके प्रभावों का अध्ययन किया जाना अभी बाकी है30।
यह तेजी से पहचाना जा रहा है कि लार्वा का विकास पराग और पाचन तंत्र के सूक्ष्मजीव समुदायों से प्रभावित होता है। मधुमक्खी माइक्रोबायोम शरीर के द्रव्यमान31, चयापचय परिवर्तन22 और रोगजनकों के प्रति संवेदनशीलता32 जैसे मापदंडों को प्रभावित करता है। पिछले अध्ययनों ने अकेले मधुमक्खियों के माइक्रोबायोम पर विकासात्मक चरण, पोषक तत्वों और पर्यावरण के प्रभाव की जांच की है। इन अध्ययनों से लार्वा और पराग माइक्रोबायोम33 की संरचना और प्रचुरता में समानताएं सामने आईं, साथ ही अकेले मधुमक्खियों की प्रजातियों में सबसे आम जीवाणु पीढ़ी स्यूडोमोनास और डेल्फ़्टिया भी। हालाँकि, कवकनाशी को मधुमक्खी के स्वास्थ्य की रक्षा करने की रणनीतियों के साथ जोड़ा गया है, लेकिन सीधे मौखिक संपर्क के माध्यम से लार्वा माइक्रोबायोटा पर कवकनाशी के प्रभावों का पता नहीं चल पाया है।
इस अध्ययन में संयुक्त राज्य अमेरिका में पेड़ों के फलों पर इस्तेमाल के लिए पंजीकृत छह सामान्य रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले कवकनाशकों की वास्तविक दुनिया की खुराक के प्रभावों का परीक्षण किया गया, जिसमें दूषित भोजन से मकई हॉर्नवॉर्म मॉथ लार्वा को मौखिक रूप से दिए जाने वाले संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशक शामिल हैं। हमने पाया कि संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशकों ने मधुमक्खियों के शरीर के वजन में वृद्धि को कम किया और मृत्यु दर में वृद्धि की, जिसमें सबसे गंभीर प्रभाव मैन्कोज़ेब और पाइरिथियोपाइड से जुड़े थे। फिर हमने मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग आहार पर खिलाए गए लार्वा की माइक्रोबियल विविधता की तुलना नियंत्रण आहार पर खिलाए गए लार्वा से की। हम मृत्यु दर के अंतर्निहित संभावित तंत्रों और एकीकृत कीट और परागण प्रबंधन (IPPM)36 कार्यक्रमों के लिए निहितार्थों पर चर्चा करते हैं।
कोकून में सर्दियां बिताने वाले वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन्स को फ्रूट रिसर्च सेंटर, बिगलेरविले, पीए से प्राप्त किया गया और -3 से 2°C (±0.3°C) पर संग्रहित किया गया। प्रयोग से पहले (कुल 600 कोकून)। मई 2022 में, 100 ओ. कॉर्निफ्रॉन्स कोकून को रोजाना प्लास्टिक के कपों (प्रति कप 50 कोकून, DI 5 cm × 15 cm लंबा) में स्थानांतरित किया गया और कप के अंदर वाइप्स रखे गए ताकि खुलने को बढ़ावा मिले और चबाने योग्य सब्सट्रेट मिले, जिससे पथरीली मधुमक्खियों पर तनाव कम हो। कोकून वाले दो प्लास्टिक कप एक कीट पिंजरे (30 × 30 × 30 सेमी, बगडॉर्म मेगाव्यू साइंस कंपनी लिमिटेड, ताइवान) में 50% सुक्रोज घोल वाले 10 मिली फीडर के साथ रखें 23 डिग्री सेल्सियस, सापेक्ष आर्द्रता 60%, फोटोपीरियड 10 एल (कम तीव्रता): 14 दिन। 100 संभोग मादाओं और नरों को सेब के चरम पुष्पन के दौरान दो कृत्रिम घोंसलों में हर सुबह छह दिनों (प्रतिदिन 100) के लिए छोड़ा गया (जाल घोंसला: चौड़ाई 33.66 × ऊंचाई 30.48 × लंबाई 46.99 सेमी; पूरक चित्र 1)। पेंसिल्वेनिया स्टेट आर्बरेटम में, चेरी (प्रूनस सेरसस 'यूबैंक' स्वीट चेरी पाई™), आड़ू (प्रूनस पर्सिका 'कंटेंडर'), प्रूनस पर्सिका 'पीएफ 27ए' फ्लेमिन फ्यूरी®), नाशपाती (पाइरस पेरिफोलिया 'ओलंपिक', पाइरस पेरिफोलिया 'शिंको', पाइरस पेरिफोलिया 'शिनसेकी'), कोरोनारिया सेब का पेड़ (मालस कोरोनारिया) और सेब के पेड़ों की कई किस्में (मालस कोरोनारिया, मालस), घरेलू सेब का पेड़ 'को-ऑप 30′ एंटरप्राइज™, मालस सेब का पेड़ 'को-ऑप 31′ वाइनक्रिस्प™, बेगोनिया 'फ्रीडम', बेगोनिया 'गोल्डन डिलीशियस', बेगोनिया 'नोवा स्पाई') के पास रखा गया। प्रत्येक नीले प्लास्टिक का बर्डहाउस दो लकड़ी के बक्सों के ऊपर फिट बैठता है। प्रत्येक घोंसले के बक्से में 800 खाली क्राफ्ट पेपर ट्यूब (सर्पिल खुली, 0.8 सेमी आईडी × 15 सेमी एल) (जोन्सविले पेपर ट्यूब कंपनी, मिशिगन) शामिल थे, जो अपारदर्शी सेलोफेन ट्यूबों (0.7 ओडी देखें प्लास्टिक प्लग (टी -1 एक्स प्लग) में घोंसले के स्थान प्रदान करते हैं।
दोनों घोंसलों के बक्से पूर्व की ओर थे और उन्हें हरे प्लास्टिक के बगीचे की बाड़ (एवरबिल्ट मॉडल #889250EB12, उद्घाटन का आकार 5 × 5 सेमी, 0.95 मीटर × 100 मीटर) से ढक दिया गया था ताकि कृंतक और पक्षी की पहुंच को रोका जा सके और घोंसले के बक्से की मिट्टी के बक्से के बगल में मिट्टी की सतह पर रखा गया था। घोंसला बॉक्स (पूरक चित्र 1a)। मकई बोरर के अंडों को घोंसलों से 30 ट्यूबों को इकट्ठा करके और उन्हें प्रयोगशाला में ले जाकर रोजाना एकत्र किया जाता था। कैंची का उपयोग करके, ट्यूब के अंत में एक कट लगाएं, फिर ब्रूड कोशिकाओं को उजागर करने के लिए सर्पिल ट्यूब को अलग करें। एक घुमावदार स्पैटुला (माइक्रोस्लाइड टूल किट, बायोक्विप प्रोडक्ट्स इंक, कैलिफोर्निया) का उपयोग करके व्यक्तिगत अंडे और उनके पराग को हटा दिया गया
प्रयोगशाला में, हमने सेब के फूल आने से पहले और उसके दौरान तीन सांद्रताओं (0.1X, 0.5X, और 1X, जहां 1X प्रति 100 गैलन पानी/एकड़ में लगाया जाने वाला निशान है) पर लागू किए गए छह कवकनाशकों की मौखिक विषाक्तता का मूल्यांकन किया। उच्च क्षेत्र खुराक = क्षेत्र में सांद्रता)। , तालिका 1)। प्रत्येक सांद्रता को 16 बार दोहराया गया (n = 16)। दो संपर्क कवकनाशकों (तालिका S1: मैन्कोजेब 2696.14 पीपीएम और कैप्टन 2875.88 पीपीएम) और चार प्रणालीगत कवकनाशकों (तालिका S1: पाइरिथियोस्ट्रोबिन 250.14 पीपीएम; ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन 110.06 पीपीएम; मायक्लोब्यूटानिल एज़ोल 75 हमने पराग को ग्राइंडर का उपयोग करके समरूप बनाया, 0.20 ग्राम को एक कुएं (24-वेल फाल्कन प्लेट) में स्थानांतरित किया, और 1 मिमी गहरे कुओं के साथ पिरामिड पराग बनाने के लिए कवकनाशी घोल का 1 μL मिलाया और मिलाया जिसमें अंडे रखे गए थे। एक मिनी स्पैटुला (पूरक चित्र 1c,d) का उपयोग करके रखें। फाल्कन प्लेट्स को कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर संग्रहीत किया गया था। हमने उनकी तुलना शुद्ध पानी से उपचारित एक सजातीय पराग आहार खिलाए गए नियंत्रण लार्वा से की। हमने मृत्यु दर दर्ज की और एक विश्लेषणात्मक संतुलन (फिशर साइंटिफिक, सटीकता = 0.0001 ग्राम) का उपयोग करके लार्वा के प्रीप्यूपल आयु तक पहुंचने तक हर दूसरे दिन लार्वा का वजन मापा। अंत में, 2.5 महीने के बाद कोकून खोलकर लिंग अनुपात का आकलन किया गया।
पूरे ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा (n = 3 प्रति उपचार स्थिति, मैन्कोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग) से डीएनए निकाला गया और हमने इन नमूनों पर माइक्रोबियल विविधता विश्लेषण किया, खासकर इसलिए क्योंकि मैन्कोज़ेब में MnZn प्राप्त करने वाले लार्वा में सबसे अधिक मृत्यु दर देखी गई थी। DNA को DNAZymoBIOMICS®-96 मैगबीड DNA किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, CA) का उपयोग करके प्रवर्धित, शुद्ध किया गया और v3 किट का उपयोग करके Illumina® MiSeq™ पर अनुक्रमित (600 चक्र) किया गया। 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को लक्षित करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके क्विक-16S™ NGS लाइब्रेरी प्रेप किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, CA) का उपयोग करके बैक्टीरियल 16S राइबोसोमल RNA जीन की लक्षित अनुक्रमण किया गया। इसके अतिरिक्त, 10% PhiX समावेशन का उपयोग करके 18S अनुक्रमण किया गया, और प्राइमर युग्म 18S001 और NS4 का उपयोग करके प्रवर्धन किया गया।
QIIME2 पाइपलाइन (v2022.11.1) का उपयोग करके युग्मित रीड्स39 को आयात और संसाधित करें। इन रीड्स को ट्रिम और मर्ज किया गया, और QIIME2 (qiime dada2 नॉइज़ पेयरिंग)40 में DADA2 प्लगइन का उपयोग करके काइमेरिक अनुक्रमों को हटा दिया गया। 16S और 18S क्लास असाइनमेंट ऑब्जेक्ट क्लासिफायर प्लगइन Classify-sklearn और प्री-ट्रेन्ड आर्टिफैक्ट silva-138-99-nb-क्लासिफायर का उपयोग करके किए गए थे।
सभी प्रायोगिक डेटा की सामान्यता (शापिरो-विल्क्स) और भिन्नताओं की समरूपता (लेवेन का परीक्षण) के लिए जाँच की गई। चूँकि डेटा सेट पैरामीट्रिक विश्लेषण की मान्यताओं को पूरा नहीं करता था और रूपांतरण अवशेषों को मानकीकृत करने में विफल रहा, इसलिए हमने लार्वा के ताजे वजन पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए दो कारकों [समय (तीन-चरण 2, 5, और 8 दिन के समय बिंदु) और कवकनाशी] के साथ एक गैर-पैरामीट्रिक दो-तरफ़ा ANOVA (क्रस्कल-वालिस) किया, फिर विलकॉक्सन परीक्षण का उपयोग करके पोस्ट हॉक गैर-पैरामीट्रिक जोड़ी तुलना की गई। हमने तीन कवकनाशी सांद्रता41,42 में जीवित रहने पर कवकनाशी के प्रभावों की तुलना करने के लिए पॉइसन वितरण के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (GLM) का उपयोग किया। विभेदक बहुतायत विश्लेषण के लिए, एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (ASV) की संख्या को जीनस स्तर पर कम कर दिया गया था। 16S (जीनस स्तर) और 18S सापेक्ष बहुतायत का उपयोग करने वाले समूहों के बीच अंतर बहुतायत की तुलना स्थिति, पैमाने और आकार (GAMLSS) के लिए एक सामान्यीकृत योगात्मक मॉडल का उपयोग करके बीटा शून्य-फुलाए गए (BEZI) परिवार वितरण के साथ की गई थी, जिसे माइक्रोबायोम R43 (v1.1) में मैक्रो पर मॉडल किया गया था। 1)। विभेदक विश्लेषण से पहले माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट प्रजातियों को हटा दें। 18S के विभिन्न वर्गीकरण स्तरों के कारण, प्रत्येक टैक्सोन के केवल निम्नतम स्तर का उपयोग विभेदक विश्लेषण के लिए किया गया था। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण R (v. 3.4.3., CRAN प्रोजेक्ट) (टीम 2013) का उपयोग करके किए गए थे।
मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के संपर्क में आने से ओ. कॉर्निफ्रॉन्स में शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 1)। ये प्रभाव तीनों खुराकों के लिए लगातार देखे गए (चित्र 1a-c)। साइक्लोस्ट्रोबिन और माइक्लोबुटानिल ने लार्वा के वजन में उल्लेखनीय कमी नहीं की।
चार आहार उपचारों (सजातीय पराग आहार + कवकनाशी: नियंत्रण, 0.1X, 0.5X और 1X खुराक) के अंतर्गत तीन समय बिंदुओं पर मापा गया तना छेदक लार्वा का औसत ताजा वजन। (ए) कम खुराक (0.1X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 30.99, DF = 6; पी < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): 22.83, DF = 0.0009; तीसरा समय; बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; (बी) आधी खुराक (0.5X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 35.67, DF = 6; पी < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (पहला दिन)। तीसरा समय बिंदु (दिन 8) χ2: 16.47, DF = 6; (c) साइट या पूरी खुराक (1X): पहला समय बिंदु (दिन 1) χ2: 20.64, P = 6; P = 0.0326, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): χ2: 22.83, DF = 6; P = 0.0009; तीसरा समय बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; विचरण का गैर-पैरामीट्रिक विश्लेषण। बार जोड़े में तुलना के औसत ± SE को दर्शाते हैं (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001।
सबसे कम खुराक (0.1X) पर, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के साथ लार्वा का शरीर का वजन 60%, मैन्कोज़ेब के साथ 49%, माइक्लोबुटानिल के साथ 48% और पाइरिथिस्ट्रोबिन के साथ 46% कम हो गया (चित्र 1a)। जब आधी फील्ड खुराक (0.5X) के संपर्क में लाया गया, तो मैन्कोज़ेब लार्वा का शरीर का वजन 86%, पाइरिथिस्ट्रोबिन 52% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन 50% कम हो गया (चित्र 1b)। मैन्कोज़ेब की पूरी फील्ड खुराक (1X) ने लार्वा के वजन को 82%, पाइरिथिस्ट्रोबिन 70% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन, माइक्लोबुटानिल और सैनगार्ड को लगभग 30% कम कर दिया (चित्र 1c)।
मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में मृत्यु दर सबसे अधिक थी, उसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन का स्थान था। मैन्कोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की बढ़ती खुराक के साथ मृत्यु दर में वृद्धि हुई (चित्र 2; तालिका 2)। हालांकि, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन सांद्रता बढ़ने पर मकई बोरर की मृत्यु दर में मामूली वृद्धि हुई; साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में मृत्यु दर में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं की।
छह अलग-अलग फफूंदनाशकों से अलग-अलग उपचारित पराग के सेवन के बाद बोरर मक्खी के लार्वा की मृत्यु दर की तुलना की गई। मकई के कीड़ों के मौखिक संपर्क के प्रति मैन्कोज़ेब और पेंटोपाइरामाइड अधिक संवेदनशील थे (जीएलएम: χ = 29.45, डीएफ = 20, पी = 0.0059) (लाइन, ढलान = 0.29, पी < 0.001; ढलान = 0.24, पी < 0.00))।
औसतन, सभी उपचारों में, 39.05% रोगी महिलाएँ थीं और 60.95% पुरुष थे। नियंत्रण उपचारों में, कम खुराक (0.1X) और आधी खुराक (0.5X) दोनों अध्ययनों में महिलाओं का अनुपात 40% था, और क्षेत्र-खुराक (1X) अध्ययनों में 30% था। 0.1X खुराक पर, मेन्कोज़ेब और माइक्लोबुटानिल के साथ इलाज किए गए पराग-पोषित लार्वा में, 33.33% वयस्क महिलाएँ थीं, 22% वयस्क महिलाएँ थीं, 44% वयस्क लार्वा महिलाएँ थीं, 44% वयस्क लार्वा महिलाएँ थीं, 41% वयस्क लार्वा महिलाएँ थीं, और नियंत्रण 31% थे (चित्र 3a)। खुराक के 0.5 गुना पर, मैन्कोज़ेब और पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 33% वयस्क कीड़े मादा थे, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 36%, माइक्लोबुटानिल समूह में 41% और साइप्रोस्ट्रोबिन समूह में 46%। यह आंकड़ा कैप्टन समूह में 53% और नियंत्रण समूह में 38% था (चित्र 3बी)। 1X खुराक पर, मैन्कोज़ेब समूह में 30% महिलाएँ थीं, पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 36%, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 44%, माइक्लोबुटानिल समूह में 38%, नियंत्रण समूह में 50% महिलाएँ थीं - 38.5% (चित्र 3सी)।
लार्वा अवस्था में कवकनाशी के संपर्क में आने के बाद मादा और नर बोरर का प्रतिशत। (ए) कम खुराक (0.1X)। (बी) आधी खुराक (0.5X)। (सी) क्षेत्र खुराक या पूरी खुराक (1X)।
16S अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि मेन्कोजेब-उपचारित पराग से भरे लार्वा और अनुपचारित पराग से भरे लार्वा के बीच जीवाणु समूह भिन्न था (चित्र 4a)। पराग पर खिलाए गए अनुपचारित लार्वा का माइक्रोबियल इंडेक्स मेन्कोजेब-उपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक था (चित्र 4b)। यद्यपि समूहों के बीच समृद्धि में देखा गया अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, यह अनुपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा के लिए देखे गए अंतर से काफी कम था (चित्र 4c)। सापेक्ष प्रचुरता से पता चला कि नियंत्रण पराग पर खिलाए गए लार्वा का माइक्रोबायोटा मेन्कोजेब-उपचारित लार्वा पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक विविध था (चित्र 5a)। वर्णनात्मक विश्लेषण ने नियंत्रण और मेन्कोजेब-उपचारित नमूनों में 28 प्रजातियों की उपस्थिति का पता लगाया (चित्र 5b)। c 18S अनुक्रमण का उपयोग करके विश्लेषण ने कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (पूरक चित्र 2)।
16S अनुक्रमों पर आधारित SAV प्रोफाइल की तुलना शैनन समृद्धि और फाइलम स्तर पर देखी गई समृद्धि से की गई। (ए) अनुपचारित पराग-पोषित या नियंत्रण (नीला) और मैन्कोजेब-पोषित लार्वा (नारंगी) में समग्र माइक्रोबियल समुदाय संरचना के आधार पर प्रमुख समन्वय विश्लेषण (पीसीओए)। प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग नमूना दर्शाता है। पीसीओए की गणना मल्टीवेरिएट टी वितरण के ब्रे-कर्टिस दूरी का उपयोग करके की गई थी। अंडाकार 80% विश्वास स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) बॉक्सप्लॉट, कच्चा शैनन धन डेटा (बिंदु) और सी। अवलोकन योग्य धन। बॉक्सप्लॉट मध्य रेखा, इंटरक्वार्टाइल रेंज (आईक्यूआर), और 1.5 × आईक्यूआर (एन = 3) के लिए बॉक्स दिखाते हैं।
मैन्कोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग पर पलने वाले लार्वा के सूक्ष्मजीवी समुदायों की संरचना। (ए) लार्वा में सूक्ष्मजीवी प्रजातियों की सापेक्षिक प्रचुरता। (बी) पहचाने गए सूक्ष्मजीवी समुदायों का हीट मैप। डेल्फ़्टिया (संभावना अनुपात (ओआर) = 0.67, पी = 0.0030) और स्यूडोमोनास (ओआर = 0.3, पी = 0.0074), माइक्रोबैक्टीरियम (ओआर = 0.75, पी = 0.0617) (ओआर = 1.5, पी = 0.0060); हीट मैप पंक्तियों को सहसंबंध दूरी और औसत कनेक्टिविटी का उपयोग करके क्लस्टर किया जाता है।
हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि फूल आने के दौरान व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले संपर्क (मैन्कोज़ेब) और प्रणालीगत (पाइरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) कवकनाशकों के मौखिक संपर्क से मक्के के लार्वा के वजन में उल्लेखनीय कमी आई और मृत्यु दर में वृद्धि हुई। इसके अलावा, मैन्कोज़ेब ने प्रीप्यूपल चरण के दौरान माइक्रोबायोम की विविधता और समृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से कम कर दिया। माइक्लोबुटानिल, एक अन्य प्रणालीगत कवकनाशक, ने तीनों खुराकों पर लार्वा के शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी की। यह प्रभाव दूसरे (5वें दिन) और तीसरे (8वें दिन) समय बिंदुओं पर स्पष्ट था। इसके विपरीत, साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण समूह की तुलना में वजन में वृद्धि या उत्तरजीविता को महत्वपूर्ण रूप से कम नहीं किया। हमारे ज्ञान के अनुसार, यह कार्य मकई की फसलों को पराग के प्रत्यक्ष संपर्क के माध्यम से बचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न कवकनाशकों की क्षेत्र दरों के प्रभावों को निर्धारित करने वाला पहला कार्य है।
सभी कवकनाशी उपचारों ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी की। मैन्कोज़ेब ने लार्वा के शरीर के वजन में 51% की औसत कमी के साथ सबसे अधिक प्रभाव डाला, उसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन का स्थान रहा। हालाँकि, अन्य अध्ययनों ने लार्वा चरणों पर कवकनाशी की क्षेत्र खुराक के प्रतिकूल प्रभावों की रिपोर्ट नहीं की है44। हालाँकि डाइथियोकार्बामेट बायोसाइड्स में कम तीव्र विषाक्तता45 पाई गई है, लेकिन मैन्कोज़ेब जैसे एथिलीन बिस्डिथियोकार्बामेट्स (EBDCS) यूरिया एथिलीन सल्फाइड में विघटित हो सकते हैं। अन्य जानवरों में इसके उत्परिवर्तजन प्रभावों को देखते हुए, यह अपघटन उत्पाद देखे गए प्रभावों46,47 के लिए जिम्मेदार हो सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एथिलीन थायोयूरिया का निर्माण उच्च तापमान48, आर्द्रता स्तर49 और उत्पाद भंडारण की अवधि50 जैसे कारकों से प्रभावित होता है। बायोसाइड्स के लिए उचित भंडारण की स्थिति इन दुष्प्रभावों को कम कर सकती है। इसके अलावा, यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण ने पाइरिथियोपाइड की विषाक्तता के बारे में चिंता व्यक्त की है, जिसे अन्य जानवरों के पाचन तंत्र के लिए कैंसरकारी पाया गया है51।
मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के मौखिक प्रशासन से कॉर्न बोरर लार्वा की मृत्यु दर बढ़ जाती है। इसके विपरीत, माइक्लोबुटानिल, सिप्रोसाइक्लिन और कैप्टन का मृत्यु दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ये परिणाम लैडर्नर एट अल.52 के परिणामों से भिन्न हैं, जिन्होंने दिखाया कि कैप्टन ने वयस्क ओ. लिग्नेरिया और एपिस मेलिफेरा एल. (हाइमेनोप्टेरा, एपिसिडे) के जीवित रहने को काफी कम कर दिया। इसके अलावा, कैप्टन और बोस्कैलिड जैसे कवकनाशी लार्वा मृत्यु दर52,53,54 या भोजन व्यवहार को बदलने का कारण पाए गए हैं55। ये परिवर्तन, बदले में, पराग की पोषण गुणवत्ता और अंततः लार्वा चरण की ऊर्जा वृद्धि को प्रभावित कर सकते हैं। नियंत्रण समूह में देखी गई मृत्यु दर अन्य अध्ययनों 56,57 के अनुरूप थी।
हमारे काम में देखा गया नर-पक्षपाती लिंग अनुपात अपर्याप्त संभोग और फूल आने के दौरान खराब मौसम की स्थिति जैसे कारकों द्वारा समझाया जा सकता है, जैसा कि पहले विसेंस और बॉश द्वारा ओ. कॉर्नुटा के लिए सुझाया गया था। हालाँकि हमारे अध्ययन में मादाओं और नरों के संभोग के लिए चार दिन थे (एक अवधि जिसे आम तौर पर सफल संभोग के लिए पर्याप्त माना जाता है), हमने तनाव को कम करने के लिए जानबूझकर प्रकाश की तीव्रता कम कर दी। हालाँकि, यह संशोधन अनजाने में संभोग प्रक्रिया में बाधा डाल सकता है61। इसके अलावा, मधुमक्खियाँ कई दिनों तक प्रतिकूल मौसम का अनुभव करती हैं, जिसमें बारिश और कम तापमान (<5°C) शामिल है, जो संभोग की सफलता को भी नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है4,23।
हालाँकि हमारा अध्ययन पूरे लार्वा माइक्रोबायोम पर केंद्रित था, लेकिन हमारे परिणाम बैक्टीरिया समुदायों के बीच संभावित संबंधों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो मधुमक्खी पोषण और कवकनाशी जोखिम के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में अनुपचारित पराग खिलाए गए लार्वा की तुलना में सूक्ष्मजीव समुदाय संरचना और प्रचुरता में उल्लेखनीय कमी आई थी। अनुपचारित पराग खाने वाले लार्वा में, बैक्टीरिया समूह प्रोटियोबैक्टीरिया और एक्टिनोबैक्टीरिया प्रमुख थे और मुख्य रूप से एरोबिक या वैकल्पिक रूप से एरोबिक थे। डेल्फ़्ट बैक्टीरिया, जो आमतौर पर अकेली मधुमक्खी प्रजातियों से जुड़े होते हैं, एंटीबायोटिक गतिविधि के लिए जाने जाते हैं, जो रोगजनकों के खिलाफ संभावित सुरक्षात्मक भूमिका का संकेत देते हैं। एक अन्य बैक्टीरिया प्रजाति, स्यूडोमोनास, अनुपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में प्रचुर मात्रा में थी, लेकिन मैन्कोज़ेब-उपचारित लार्वा में काफी कम हो गई थी। हमारे परिणाम पिछले अध्ययनों का समर्थन करते हैं जो स्यूडोमोनास को ओ. बाइकोर्निस35 और अन्य अकेले ततैया34 में सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले जेनेरा में से एक के रूप में पहचानते हैं। हालाँकि ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य में स्यूडोमोनास की भूमिका के लिए प्रायोगिक साक्ष्य का अध्ययन नहीं किया गया है, लेकिन यह जीवाणु बीटल पैडरस फ्यूसिपेस में सुरक्षात्मक विषाक्त पदार्थों के संश्लेषण को बढ़ावा देने और इन विट्रो 35, 65 में आर्जिनिन चयापचय को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। ये अवलोकन ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा के विकास के समय वायरल और बैक्टीरियल रक्षा में एक संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं। माइक्रोबैक्टीरियम हमारे अध्ययन में पहचाना गया एक और जीनस है जो भुखमरी की स्थिति में ब्लैक सोल्जर फ्लाई लार्वा में उच्च संख्या में मौजूद होने की सूचना है66। ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में, माइक्रोबैक्टीरिया तनाव की स्थिति में आंत माइक्रोबायोम के संतुलन और लचीलेपन में योगदान दे सकते हैं। इसके अतिरिक्त, रोडोकॉकस ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में पाया जाता है और इसकी विषहरण क्षमताओं के लिए जाना जाता है67। यह जीनस ए. फ्लोरिया की आंत में भी पाया जाता है, लेकिन बहुत कम मात्रा में68। हमारे परिणाम कई माइक्रोबियल टैक्सा में कई आनुवंशिक विविधताओं की उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं जो लार्वा में चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं। हालाँकि, ओ. कॉर्निफ्रॉन्स की कार्यात्मक विविधता की बेहतर समझ की आवश्यकता है।
संक्षेप में, परिणाम दर्शाते हैं कि मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन ने शरीर के वजन में वृद्धि को कम किया और कॉर्न बोरर लार्वा की मृत्यु दर में वृद्धि की। हालाँकि परागणकों पर कवकनाशियों के प्रभावों के बारे में चिंता बढ़ रही है, लेकिन इन यौगिकों के अवशिष्ट मेटाबोलाइट्स के प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता है। इन परिणामों को एकीकृत परागण प्रबंधन कार्यक्रमों के लिए सिफारिशों में शामिल किया जा सकता है जो किसानों को कवकनाशियों का चयन करके और आवेदन के समय को बदलकर या कम हानिकारक विकल्पों के उपयोग को प्रोत्साहित करके फलों के पेड़ों के फूलने से पहले और उसके दौरान कुछ कवकनाशियों के उपयोग से बचने में मदद करते हैं। 36. यह जानकारी कीटनाशकों के उपयोग पर सिफारिशें विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि मौजूदा स्प्रे कार्यक्रमों को समायोजित करना और कवकनाशियों का चयन करते समय या कम खतरनाक विकल्पों के उपयोग को बढ़ावा देते समय स्प्रे समय को बदलना। लिंग अनुपात, भोजन व्यवहार, आंत माइक्रोबायोम और कॉर्न बोरर वजन घटाने और मृत्यु दर के अंतर्निहित आणविक तंत्र पर कवकनाशियों के प्रतिकूल प्रभावों पर आगे अनुसंधान की आवश्यकता है।
चित्र 1 और 2 में स्रोत डेटा 1, 2 और 3 को फ़िगशेयर डेटा रिपॉजिटरी DOI में जमा किया गया है: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 और https://doi.org/10.6084/m9. figshare.24996233. वर्तमान अध्ययन (चित्र 4, 5) में विश्लेषण किए गए अनुक्रम NCBI SRA रिपॉजिटरी में एक्सेस नंबर PRJNA1023565 के तहत उपलब्ध हैं।
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