कवकनाशी अनुपूरण से एकल राजमिस्त्री मधुमक्खियों में शुद्ध ऊर्जा लाभ और माइक्रोबायोम विविधता कम हो जाती है।

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पेड़ों के फलों के पुष्पन के दौरान अक्सर कवकनाशकों का प्रयोग किया जाता है और ये कीट परागणकों के लिए खतरा पैदा कर सकते हैं। हालाँकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी है कि गैर-मधुमक्खी परागणकर्ता (जैसे, एकांत मधुमक्खियाँ, ओस्मिया कॉर्निफ्रॉन) पुष्पन के दौरान सेबों पर आमतौर पर प्रयोग किए जाने वाले संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशकों के प्रति कैसी प्रतिक्रिया देते हैं। ज्ञान का यह अंतर कवकनाशक छिड़काव की सुरक्षित सांद्रता और समय निर्धारित करने वाले नियामक निर्णयों को सीमित करता है। हमने दो संपर्क कवकनाशकों (कैप्टन और मैंकोज़ेब) और चार अंतरपरत/पादपतंत्र कवकनाशकों (सिप्रोसाइक्लिन, माइकोब्यूटानिल, पायरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सिस्ट्रोबिन) के प्रभावों का आकलन किया। लार्वा के भार वृद्धि, उत्तरजीविता, लिंग अनुपात और जीवाणु विविधता पर प्रभाव। मूल्यांकन एक दीर्घकालिक मौखिक जैव-परीक्षण का उपयोग करके किया गया जिसमें पराग का उपचार क्षेत्र उपयोग के लिए वर्तमान में अनुशंसित खुराक (1X), आधी खुराक (0.5X) और कम खुराक (0.1X) के आधार पर तीन खुराकों में किया गया। मैंकोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की सभी खुराकों ने शरीर के भार और लार्वा के उत्तरजीविता को उल्लेखनीय रूप से कम कर दिया। फिर हमने उच्चतम मृत्यु दर के लिए ज़िम्मेदार कवकनाशी, मैन्कोज़ेब के लार्वा जीवाणुओं की पहचान करने के लिए 16S जीन का अनुक्रमण किया। हमने पाया कि मैन्कोज़ेब-उपचारित परागकणों से पोषित लार्वा में जीवाणुओं की विविधता और प्रचुरता में उल्लेखनीय कमी आई। हमारे प्रयोगशाला परिणामों से संकेत मिलता है कि इनमें से कुछ कवकनाशियों का फूल आने के दौरान छिड़काव ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य के लिए विशेष रूप से हानिकारक है। यह जानकारी फल वृक्ष संरक्षण उत्पादों के सतत उपयोग से संबंधित भविष्य के प्रबंधन निर्णयों के लिए प्रासंगिक है और परागणकों की सुरक्षा के उद्देश्य से नियामक प्रक्रियाओं के आधार के रूप में कार्य करती है।
एकाकी मेसन मधुमक्खी ओस्मिया कॉर्निफ्रॉन्स (हाइमेनोप्टेरा: मेगाचिलिडे) को 1970 के दशक के अंत और 1980 के दशक के प्रारंभ में जापान से संयुक्त राज्य अमेरिका लाया गया था, और तब से इस प्रजाति ने प्रबंधित पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण परागणकर्ता की भूमिका निभाई है। इस मधुमक्खी की प्राकृतिक आबादी जंगली मधुमक्खियों की लगभग 50 प्रजातियों का हिस्सा है जो संयुक्त राज्य अमेरिका में बादाम और सेब के बागों में परागण करने वाली मधुमक्खियों की पूरक हैं2,3। मेसन मधुमक्खियों को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जिनमें आवास विखंडन, रोगजनक और कीटनाशक3,4 शामिल हैं। कीटनाशकों में, कवकनाशी ऊर्जा लाभ, चारागाह5 और शरीर की कंडीशनिंग6,7 को कम करते हैं। हालाँकि हाल के शोध से पता चलता है कि मेसन मधुमक्खियों का स्वास्थ्य सीधे तौर पर सहभोजी और बाह्यजीव सूक्ष्मजीवों से प्रभावित होता है8,9 क्योंकि बैक्टीरिया और कवक पोषण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, मेसन मधुमक्खियों की सूक्ष्मजीव विविधता पर कवकनाशी के प्रभावों का अध्ययन अभी शुरू हुआ है।
सेब की पपड़ी, कड़वी सड़न, भूरी सड़न और चूर्णी फफूंदी जैसी बीमारियों के इलाज के लिए फूलों से पहले और उनके दौरान बागों में विभिन्न प्रभावों (संपर्क और प्रणालीगत) वाले कवकनाशकों का छिड़काव किया जाता है।10,11. कवकनाशकों को परागणकों के लिए हानिरहित माना जाता है, इसलिए फूलों की अवधि के दौरान बागवानों को इनकी सलाह दी जाती है; मधुमक्खियों द्वारा इन कवकनाशकों के संपर्क और अंतर्ग्रहण के बारे में अपेक्षाकृत अच्छी जानकारी है, क्योंकि यह अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और कई अन्य राष्ट्रीय नियामक एजेंसियों द्वारा कीटनाशक पंजीकरण प्रक्रिया का हिस्सा है।12,13,14। हालाँकि, गैर-मधुमक्खियों पर कवकनाशकों के प्रभाव कम ज्ञात हैं क्योंकि संयुक्त राज्य अमेरिका में विपणन प्राधिकरण समझौतों के तहत इनकी आवश्यकता नहीं है।15. इसके अलावा, एकल मधुमक्खियों के परीक्षण के लिए आमतौर पर कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं हैं।16,17, और परीक्षण के लिए मधुमक्खियाँ प्रदान करने वाली कॉलोनियों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है।18. जंगली मधुमक्खियों पर कीटनाशकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए यूरोप और अमेरिका में विभिन्न प्रबंधित मधुमक्खियों के परीक्षण तेजी से किए जा रहे हैं, और हाल ही में ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।
सींग वाली मधुमक्खियाँ मोनोसाइट्स होती हैं और कार्प फसलों में शहद की मक्खियों के पूरक या प्रतिस्थापन के रूप में व्यावसायिक रूप से उपयोग की जाती हैं। ये मधुमक्खियाँ मार्च और अप्रैल के बीच निकलती हैं, जिनमें समय से पहले नर मादाओं से तीन से चार दिन पहले निकलते हैं। संभोग के बाद, मादा सक्रिय रूप से पराग और रस एकत्र करती है ताकि नलिकाकार घोंसला गुहा (प्राकृतिक या कृत्रिम)1,20 के भीतर कई अंडकोष कोशिकाएँ बनाई जा सकें। अंडे कोशिकाओं के अंदर पराग पर दिए जाते हैं; फिर मादा अगली कोशिका तैयार करने से पहले एक मिट्टी की दीवार बनाती है। पहले चरण के लार्वा जरायु में बंद रहते हैं और भ्रूणीय द्रव्यों पर भोजन करते हैं। दूसरे से पाँचवें चरण (प्रीप्यूपा) तक, लार्वा पराग पर भोजन करते हैं22। पराग की आपूर्ति पूरी तरह से समाप्त हो जाने पर, लार्वा कोकून बनाते हैं, प्यूपा बनते हैं और उसी अंडकोष कक्ष में वयस्क के रूप में निकलते हैं, आमतौर पर गर्मियों के अंत में20,23। वयस्क अगले वसंत में निकलते हैं। वयस्क का जीवित रहना भोजन के सेवन के आधार पर शुद्ध ऊर्जा लाभ (वजन वृद्धि) से जुड़ा है। इस प्रकार, पराग की पोषण गुणवत्ता, साथ ही मौसम या कीटनाशकों के संपर्क जैसे अन्य कारक, अस्तित्व और स्वास्थ्य के निर्धारक हैं।
फूल आने से पहले इस्तेमाल किए जाने वाले कीटनाशक और कवकनाशी पौधे की रक्त वाहिकाओं के भीतर अलग-अलग डिग्री तक स्थानांतरित करने में सक्षम होते हैं, ट्रांसलेमिनर (जैसे, कुछ कवकनाशी की तरह पत्तियों की ऊपरी सतह से निचली सतह तक जाने में सक्षम) 25 से लेकर वास्तव में प्रणालीगत प्रभावों तक। , जो जड़ों से मुकुट में प्रवेश कर सकते हैं, सेब के फूलों के रस में प्रवेश कर सकते हैं26, जहां वे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन्स27 को मार सकते हैं। कुछ कीटनाशक पराग में भी घुल जाते हैं, मक्का के लार्वा के विकास को प्रभावित करते हैं और उनकी मृत्यु का कारण बनते हैं19। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि कुछ कवकनाशी संबंधित प्रजाति ओ. लिग्नेरिया28 के घोंसले के शिकार व्यवहार को महत्वपूर्ण रूप से बदल सकते हैं फूल खिलने के दौरान खुले फूलों पर सीधे लगाए जाने वाले विभिन्न कवकनाशी स्प्रे, लार्वा विकास के लिए वयस्कों द्वारा एकत्रित पराग को दूषित कर सकते हैं, जिसके प्रभावों का अध्ययन किया जाना बाकी है30।
यह बात तेजी से स्वीकार की जा रही है कि लार्वा का विकास पराग और पाचन तंत्र के सूक्ष्मजीव समुदायों से प्रभावित होता है। मधुमक्खी का माइक्रोबायोम शरीर द्रव्यमान31, चयापचय परिवर्तनों22 और रोगजनकों के प्रति संवेदनशीलता32 जैसे मापदंडों को प्रभावित करता है। पिछले अध्ययनों ने एकल मधुमक्खियों के माइक्रोबायोम पर विकासात्मक अवस्था, पोषक तत्वों और पर्यावरण के प्रभाव की जाँच की है। इन अध्ययनों से एकल मधुमक्खी प्रजातियों में लार्वा और पराग माइक्रोबायोम33 की संरचना और प्रचुरता, साथ ही सबसे आम जीवाणु वंश स्यूडोमोनास और डेल्फ़्टिया में समानताएँ सामने आईं। हालाँकि, कवकनाशी को मधुमक्खी के स्वास्थ्य की रक्षा की रणनीतियों से जोड़ा गया है, फिर भी प्रत्यक्ष मौखिक संपर्क के माध्यम से लार्वा माइक्रोबायोटा पर कवकनाशी के प्रभावों का अभी तक पता नहीं चला है।
इस अध्ययन में संयुक्त राज्य अमेरिका में वृक्ष फलों पर उपयोग के लिए पंजीकृत छह सामान्यतः प्रयुक्त कवकनाशकों की वास्तविक खुराकों के प्रभावों का परीक्षण किया गया, जिनमें दूषित भोजन से प्राप्त कॉर्न हॉर्नवॉर्म मॉथ लार्वा को मुँह द्वारा दिए गए संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशक शामिल हैं। हमने पाया कि संपर्क और प्रणालीगत कवकनाशकों ने मधुमक्खियों के शरीर के वजन में वृद्धि को कम किया और मृत्यु दर में वृद्धि की, जिसका सबसे गंभीर प्रभाव मैन्कोज़ेब और पाइरिथियोपाइड से जुड़ा था। फिर हमने मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग आहार पर खिलाए गए लार्वा की सूक्ष्मजीव विविधता की तुलना नियंत्रित आहार पर खिलाए गए लार्वा से की। हम मृत्यु दर के अंतर्निहित संभावित तंत्रों और एकीकृत कीट एवं परागण प्रबंधन (आईपीपीएम)36 कार्यक्रमों के निहितार्थों पर चर्चा करते हैं।
कोकून में सर्दियां बिता रहे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन को फल अनुसंधान केंद्र, बिगलेरविले, पीए से प्राप्त किया गया और -3 से 2°C (±0.3°C) पर संग्रहित किया गया। प्रयोग से पहले (कुल 600 कोकून)। मई 2022 में, 100 ओ. कॉर्निफ्रॉन कोकून को रोजाना प्लास्टिक के कपों (प्रति कप 50 कोकून, DI 5 सेमी × 15 सेमी लंबा) में स्थानांतरित किया गया और कपों के अंदर वाइप्स रखे गए ताकि वे खुल सकें और चबाने योग्य सब्सट्रेट प्रदान कर सकें, जिससे पथरीली मधुमक्खियों पर तनाव कम हो सके37 । कोकून वाले दो प्लास्टिक कपों को एक कीट पिंजरे (30 × 30 × 30 सेमी, बगडॉर्म मेगाव्यू साइंस कंपनी लिमिटेड, ताइवान) में 10 मिलीलीटर फीडर के साथ रखें जिसमें 50% सुक्रोज घोल हो 23°C, सापेक्ष आर्द्रता 60%, प्रकाश अवधि 10 l (कम तीव्रता): 14 दिन। 100 संभोग करने वाली मादाओं और नरों को सेब के फूलों के चरम के दौरान दो कृत्रिम घोंसलों में छह दिनों (प्रतिदिन 100) के लिए हर सुबह छोड़ा गया (जाल घोंसला: चौड़ाई 33.66 × ऊंचाई 30.48 × लंबाई 46.99 सेमी; पूरक चित्र 1)। पेंसिल्वेनिया स्टेट आर्बोरेटम में चेरी (प्रूनस सेरसस 'यूबैंक' स्वीट चेरी पाई™), आड़ू (प्रूनस पर्सिका 'कंटेंडर'), प्रूनस पर्सिका 'पीएफ 27ए' फ्लेमिन फ्यूरी®), नाशपाती (पाइरस पेरिफोलिया 'ओलंपिक', पाइरस पेरिफोलिया 'शिंको', पाइरस पेरिफोलिया 'शिनसेकी'), कोरोनारिया सेब का पेड़ (मालस कोरोनारिया) और सेब के पेड़ों की कई किस्में (मालस कोरोनारिया, मालस), घरेलू सेब का पेड़ 'को-ऑप 30' एंटरप्राइज™, मालस सेब का पेड़ 'को-ऑप 31' वाइनक्रिस्प™, बेगोनिया 'फ्रीडम', बेगोनिया 'गोल्डन डिलीशियस', बेगोनिया 'नोवा स्पाई') के पास रखा गया। प्रत्येक नीले प्लास्टिक का बर्डहाउस दो लकड़ी के बक्सों के ऊपर फिट बैठता है। प्रत्येक घोंसले के बक्से में 800 खाली क्राफ्ट पेपर ट्यूब (सर्पिल खुले, 0.8 सेमी आईडी × 15 सेमी एल) (जोन्सविले पेपर ट्यूब कंपनी, मिशिगन) शामिल थे, जो अपारदर्शी सेलोफेन ट्यूबों (0.7 ओडी देखें प्लास्टिक प्लग (टी -1 एक्स प्लग) में घोंसले के स्थान प्रदान करते हैं।
दोनों घोंसले के बक्से पूर्व की ओर थे और कृंतक और पक्षी की पहुंच को रोकने के लिए हरे प्लास्टिक के बगीचे की बाड़ (एवरबिल्ट मॉडल #889250EB12, उद्घाटन आकार 5 × 5 सेमी, 0.95 मीटर × 100 मीटर) के साथ कवर किए गए थे और घोंसले के बक्से की मिट्टी के बक्से के बगल में मिट्टी की सतह पर रखा गया था। घोंसला बॉक्स (पूरक चित्र 1 ए)। मकई बोरर के अंडे घोंसले से 30 ट्यूबों को इकट्ठा करके और उन्हें प्रयोगशाला में ले जाकर दैनिक रूप से एकत्र किए गए थे। कैंची का उपयोग करके, ट्यूब के अंत में एक कट बनाएं, फिर ब्रूड कोशिकाओं को उजागर करने के लिए सर्पिल ट्यूब को अलग करें। एक घुमावदार स्पैटुला (माइक्रोस्लाइड टूल किट, बायोक्विप प्रोडक्ट्स इंक, कैलिफोर्निया) का उपयोग करके व्यक्तिगत अंडे और उनके पराग को हटा दिया गया
प्रयोगशाला में, हमने सेब के फूल आने से पहले और उसके दौरान तीन सांद्रताओं (0.1X, 0.5X, और 1X, जहां 1X प्रति 100 गैलन पानी/एकड़ में लगाया जाने वाला चिह्न है) पर इस्तेमाल किए गए छह कवकनाशकों की मौखिक विषाक्तता का मूल्यांकन किया। उच्च क्षेत्र खुराक = खेत में सांद्रता)। , तालिका 1)। प्रत्येक सांद्रता को 16 बार दोहराया गया (n = 16)। दो संपर्क कवकनाशकों (तालिका S1: मैन्कोजेब 2696.14 पीपीएम और कैप्टन 2875.88 पीपीएम) और चार प्रणालीगत कवकनाशकों (तालिका S1: पाइरिथियोस्ट्रोबिन 250.14 पीपीएम; ट्राइफ्लोक्सिस्ट्रोबिन 110.06 पीपीएम; मायक्लोब्यूटानिल एज़ोल 75 हमने पराग को ग्राइंडर का उपयोग करके समरूप बनाया, 0.20 ग्राम को एक कुएं (24-वेल फाल्कन प्लेट) में स्थानांतरित किया, और 1 मिमी गहरे कुओं वाले पिरामिड पराग बनाने के लिए 1 μL कवकनाशी घोल मिलाया और मिलाया जिसमें अंडे रखे गए। एक मिनी स्पैटुला (पूरक चित्र 1c,d) का उपयोग करके रखें। फाल्कन प्लेटों को कमरे के तापमान (25°C) और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर संग्रहित किया गया था। हमने उनकी तुलना शुद्ध पानी से उपचारित एक सजातीय पराग आहार खिलाए गए नियंत्रण लार्वा से की। हमने मृत्यु दर दर्ज की और हर दूसरे दिन लार्वा का वजन मापा जब तक कि लार्वा एक विश्लेषणात्मक संतुलन (फिशर साइंटिफिक, सटीकता = 0.0001 ग्राम) का उपयोग करके प्रीप्युपल उम्र तक नहीं पहुंच गया।
संपूर्ण ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा (प्रत्येक उपचार स्थिति में n = 3, मैन्कोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग) से डीएनए निकाला गया और हमने इन नमूनों पर सूक्ष्मजीव विविधता विश्लेषण किया, खासकर इसलिए क्योंकि मैन्कोज़ेब में MnZn प्राप्त करने वाले लार्वा में सबसे अधिक मृत्यु दर देखी गई थी। DNA को DNAZymoBIOMICS®-96 मैगबीड डीएनए किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके प्रवर्धित और शुद्ध किया गया, और v3 किट का उपयोग करके Illumina® MiSeq™ पर अनुक्रमित (600 चक्र) किया गया। 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को लक्षित करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके क्विक-16S™ NGS लाइब्रेरी प्रेप किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके जीवाणु 16S राइबोसोमल RNA जीन का लक्षित अनुक्रमण किया गया। इसके अतिरिक्त, 10% PhiX समावेशन का उपयोग करके 18S अनुक्रमण किया गया, और प्राइमर युग्म 18S001 और NS4 का उपयोग करके प्रवर्धन किया गया।
QIIME2 पाइपलाइन (v2022.11.1) का उपयोग करके युग्मित रीड्स39 को आयात और संसाधित करें। इन रीड्स को ट्रिम और मर्ज किया गया, और QIIME2 में DADA2 प्लगइन (qiime dada2 नॉइज़ पेयरिंग)40 का उपयोग करके काइमेरिक अनुक्रमों को हटाया गया। 16S और 18S क्लास असाइनमेंट ऑब्जेक्ट क्लासिफायर प्लगइन Classify-sklearn और पूर्व-प्रशिक्षित आर्टिफैक्ट silva-138-99-nb-क्लासिफायर का उपयोग करके किए गए।
सभी प्रायोगिक आँकड़ों की सामान्यता (शापिरो-विल्क्स) और प्रसरणों की समरूपता (लेवेन परीक्षण) के लिए जाँच की गई। चूँकि आँकड़ा समूह पैरामीट्रिक विश्लेषण की मान्यताओं को पूरा नहीं करता था और रूपांतरण अवशिष्टों को मानकीकृत करने में विफल रहा, इसलिए हमने लार्वा के ताज़ा भार पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए दो कारकों [समय (तीन-चरण 2, 5, और 8 दिन के समय बिंदु) और कवकनाशी] के साथ एक गैर-पैरामीट्रिक दो-तरफ़ा ANOVA (क्रस्कल-वालिस) किया, फिर विल्कोक्सन परीक्षण का उपयोग करके पोस्ट हॉक गैर-पैरामीट्रिक जोड़ीवार तुलनाएँ की गईं। हमने तीन कवकनाशी सांद्रताओं41,42 में उत्तरजीविता पर कवकनाशी के प्रभावों की तुलना करने के लिए पॉइसन वितरण के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (GLM) का उपयोग किया। विभेदक प्रचुरता विश्लेषण के लिए, एम्प्लिकॉन अनुक्रम रूपों (ASV) की संख्या को जीनस स्तर पर संक्षिप्त किया गया था। 16S (जीनस स्तर) और 18S सापेक्ष प्रचुरता का उपयोग करने वाले समूहों के बीच विभेदक प्रचुरता की तुलना, स्थिति, पैमाने और आकृति (GAMLSS) के लिए एक सामान्यीकृत योगात्मक मॉडल का उपयोग करके, बीटा शून्य-फुलाए गए (BEZI) परिवार वितरण के साथ की गई, जिसे माइक्रोबायोम R43 (v1.1) में एक मैक्रो पर मॉडल किया गया था। 1) विभेदक विश्लेषण से पहले माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट प्रजातियों को हटा दें। 18S के विभिन्न वर्गीकरण स्तरों के कारण, विभेदक विश्लेषण के लिए प्रत्येक वर्गक के केवल निम्नतम स्तर का उपयोग किया गया था। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण R (v. 3.4.3., CRAN परियोजना) (टीम 2013) का उपयोग करके किए गए थे।
मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के संपर्क में आने से ओ. कॉर्निफ्रॉन्स में शरीर के वज़न में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 1)। ये प्रभाव तीनों खुराकों (चित्र 1a-c) के लिए लगातार देखे गए। साइक्लोस्ट्रोबिन और माइक्लोब्यूटानिल ने लार्वा के वज़न में कोई उल्लेखनीय कमी नहीं की।
चार आहार उपचारों (सजातीय पराग आहार + कवकनाशी: नियंत्रण, 0.1X, 0.5X और 1X खुराक) के तहत तीन समय बिंदुओं पर मापा गया स्टेम बोरर लार्वा का औसत ताजा वजन। (ए) कम खुराक (0.1X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 30.99, DF = 6; पी < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): 22.83, DF = 0.0009; तीसरा समय; बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; (बी) आधी खुराक (0.5X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 35.67, DF = 6; पी < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन एक)। तीसरा समय बिंदु (दिन 8) χ2: 16.47, DF = 6; (c) साइट या पूरी खुराक (1X): पहला समय बिंदु (दिन 1) χ2: 20.64, P = 6; P = 0.0326, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): χ2: 22.83, DF = 6; P = 0.0009; तीसरा समय बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; विचरण का गैर-पैरामीट्रिक विश्लेषण। पट्टियाँ युग्मित तुलनाओं के माध्य ± SE को दर्शाती हैं (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001।
न्यूनतम खुराक (0.1X) पर, ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन से लार्वा का शरीर भार 60%, मैन्कोज़ेब से 49%, माइक्लोब्यूटानिल से 48% और पाइरिथिस्ट्रोबिन से 46% कम हुआ (चित्र 1a)। आधी क्षेत्र खुराक (0.5X) के संपर्क में आने पर, मैन्कोज़ेब लार्वा का शरीर भार 86%, पाइरिथिस्ट्रोबिन 52% और ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन 50% कम हो गया (चित्र 1b)। मैन्कोज़ेब की पूरी क्षेत्र खुराक (1X) ने लार्वा भार 82%, पाइरिथिस्ट्रोबिन 70%, और ट्राइफ्लॉक्सीस्ट्रोबिन, माइक्लोब्यूटानिल और सैंगर्ड लगभग 30% कम कर दिया (चित्र 1c)।
मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में मृत्यु दर सबसे अधिक थी, उसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन का स्थान था। मैन्कोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की बढ़ती खुराक के साथ मृत्यु दर में वृद्धि हुई (चित्र 2; तालिका 2)। हालाँकि, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन की सांद्रता बढ़ने पर मक्का बोरर की मृत्यु दर में मामूली वृद्धि हुई; साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में मृत्यु दर में कोई उल्लेखनीय वृद्धि नहीं की।
छह अलग-अलग कवकनाशी से अलग-अलग उपचारित परागकणों के अंतर्ग्रहण के बाद बोरर मक्खी के लार्वा की मृत्यु दर की तुलना की गई। मैन्कोज़ेब और पेंटोपाइरामाइड मक्के के कीड़ों के मुँह से संपर्क में आने पर ज़्यादा संवेदनशील थे (GLM: χ = 29.45, DF = 20, P = 0.0059) (रेखा, ढलान = 0.29, P < 0.001; ढलान = 0.24, P < 0.00))।
औसतन, सभी उपचारों में, 39.05% रोगी महिलाएँ और 60.95% पुरुष थे। नियंत्रण उपचारों में, कम-खुराक (0.1X) और आधी-खुराक (0.5X) दोनों अध्ययनों में महिलाओं का अनुपात 40% था, और क्षेत्र-खुराक (1X) अध्ययनों में 30% था। 0.1X खुराक पर, मैंकोज़ेब और माइकोब्यूटानिल से उपचारित पराग-पोषित लार्वा में, 33.33% वयस्क मादाएँ, 22% वयस्क मादाएँ, 44% वयस्क लार्वा मादाएँ, 44% वयस्क लार्वा मादाएँ, 41% वयस्क लार्वा मादाएँ, और नियंत्रण समूह में 31% थे (चित्र 3a)। खुराक के 0.5 गुना पर, मैन्कोज़ेब और पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 33% वयस्क कृमि मादा थे, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 36%, माइक्लोब्यूटानिल समूह में 41% और साइप्रोस्ट्रोबिन समूह में 46%। यह आँकड़ा कैप्टन समूह में 53% और नियंत्रण समूह में 38% था (चित्र 3b)। 1X खुराक पर, मैन्कोज़ेब समूह में 30% महिलाएँ थीं, पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 36%, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 44%, माइक्लोब्यूटानिल समूह में 38%, नियंत्रण समूह में 50% महिलाएँ थीं - 38.5% (चित्र 3c)।
लार्वा अवस्था में कवकनाशी के संपर्क में आने के बाद मादा और नर बोरर्स का प्रतिशत. (ए) कम खुराक (0.1X). ​​(बी) आधी खुराक (0.5X). (सी) फील्ड खुराक या पूरी खुराक (1X).
16S अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि मैंकोज़ेब-उपचारित पराग और अनुपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा के बीच जीवाणु समूह में अंतर था (चित्र 4a)। पराग पर खिलाए गए अनुपचारित लार्वा का माइक्रोबियल सूचकांक मैंकोज़ेब-उपचारित पराग पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक था (चित्र 4b)। यद्यपि समूहों के बीच समृद्धि में देखा गया अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, यह अनुपचारित पराग पर खिलाने वाले लार्वा के लिए देखे गए अंतर से काफी कम था (चित्र 4c)। सापेक्ष प्रचुरता से पता चला कि नियंत्रित पराग पर खिलाए गए लार्वा का माइक्रोबायोटा मैंकोज़ेब-उपचारित लार्वा पर खिलाए गए लार्वा की तुलना में अधिक विविध था (चित्र 5a)। वर्णनात्मक विश्लेषण से नियंत्रण और मैंकोज़ेब-उपचारित नमूनों में 28 प्रजातियों की उपस्थिति का पता चला (चित्र 5b)। c
16S अनुक्रमों पर आधारित SAV प्रोफाइल की तुलना शैनन समृद्धि और फ़ाइलम स्तर पर प्रेक्षित समृद्धि से की गई। (a) अनुपचारित पराग-पोषित या नियंत्रण (नीला) और मैन्कोज़ेब-पोषित लार्वा (नारंगी) में समग्र सूक्ष्मजीव समुदाय संरचना पर आधारित मुख्य निर्देशांक विश्लेषण (PCoA)। प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग नमूने का प्रतिनिधित्व करता है। PCoA की गणना बहुभिन्नरूपी t वितरण की ब्रे-कर्टिस दूरी का उपयोग करके की गई। अंडाकार 80% विश्वास स्तर दर्शाते हैं। (b) बॉक्सप्लॉट, अपरिष्कृत शैनन समृद्धि डेटा (बिंदु) और c. प्रेक्षणीय समृद्धि। बॉक्सप्लॉट मध्य रेखा, इंटरक्वार्टाइल रेंज (IQR), और 1.5 × IQR (n = 3) के लिए बॉक्स दिखाते हैं।
मैन्कोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग पर पलने वाले लार्वा के सूक्ष्मजीवी समुदायों की संरचना। (क) लार्वा में सूक्ष्मजीवी वंशों की सापेक्षिक प्रचुरता। (ख) पहचाने गए सूक्ष्मजीवी समुदायों का हीट मैप। डेल्फ़्टिया (संभावना अनुपात (OR) = 0.67, P = 0.0030) और स्यूडोमोनास (OR = 0.3, P = 0.0074), माइक्रोबैक्टीरियम (OR = 0.75, P = 0.0617) (OR = 1.5, P = 0.0060); हीट मैप पंक्तियों को सहसंबंध दूरी और औसत कनेक्टिविटी का उपयोग करके समूहीकृत किया गया है।
हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि पुष्पन के दौरान व्यापक रूप से प्रयुक्त संपर्क (मैन्कोजेब) और प्रणालीगत (पाइरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) कवकनाशकों के मौखिक संपर्क से मक्के के लार्वा के वजन में उल्लेखनीय कमी आई और मृत्यु दर में भी वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, मैन्कोजेब ने प्यूपा-पूर्व अवस्था के दौरान सूक्ष्मजीवोम की विविधता और समृद्धि को उल्लेखनीय रूप से कम कर दिया। एक अन्य प्रणालीगत कवकनाशक, माइकोब्यूटानिल ने तीनों खुराकों पर लार्वा के शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी की। यह प्रभाव दूसरे (5वें दिन) और तीसरे (8वें दिन) समय बिंदुओं पर स्पष्ट था। इसके विपरीत, साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण समूह की तुलना में वजन में वृद्धि या उत्तरजीविता को उल्लेखनीय रूप से कम नहीं किया।
सभी कवकनाशी उपचारों ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी की। लार्वा के शरीर के वजन में वृद्धि पर मैन्कोज़ेब का सबसे अधिक प्रभाव पड़ा, जिसमें औसतन 51% की कमी आई, उसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन का स्थान रहा। हालाँकि, अन्य अध्ययनों में लार्वा अवस्थाओं पर कवकनाशियों की क्षेत्रीय खुराक के प्रतिकूल प्रभावों की सूचना नहीं मिली है44। हालाँकि डाइथियोकार्बामेट जैवनाशियों में कम तीव्र विषाक्तता45 पाई गई है, लेकिन मैन्कोज़ेब जैसे एथिलीन बिस्डाइथियोकार्बामेट (EBDCS) यूरिया एथिलीन सल्फाइड में विघटित हो सकते हैं। अन्य जंतुओं में इसके उत्परिवर्तजन प्रभावों को देखते हुए, यह अपघटन उत्पाद देखे गए प्रभावों46,47 के लिए उत्तरदायी हो सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एथिलीन थायोयूरिया का निर्माण उच्च तापमान48, आर्द्रता स्तर49 और उत्पाद भंडारण अवधि50 जैसे कारकों से प्रभावित होता है। जैवनाशियों के लिए उचित भंडारण परिस्थितियाँ इन दुष्प्रभावों को कम कर सकती हैं। इसके अलावा, यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण ने पाइरिथियोपाइड की विषाक्तता के बारे में चिंता व्यक्त की है, जिसे अन्य जानवरों के पाचन तंत्र के लिए कैंसरकारी पाया गया है51।
मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के मौखिक प्रशासन से मक्का बोरर लार्वा की मृत्यु दर बढ़ जाती है। इसके विपरीत, माइकोब्यूटानिल, सिप्रोसाइक्लिन और कैप्टन का मृत्यु दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ये परिणाम लैडर्नर एट अल.52 के परिणामों से भिन्न हैं, जिन्होंने दिखाया कि कैप्टन ने वयस्क ओ. लिग्नेरिया और एपिस मेलिफेरा एल. (हाइमेनोप्टेरा, एपिसिडी) के जीवित रहने की दर को महत्वपूर्ण रूप से कम कर दिया। इसके अलावा, कैप्टन और बोस्केलिड जैसे कवकनाशी लार्वा मृत्यु दर52,53,54 या भोजन व्यवहार में बदलाव55 का कारण पाए गए हैं। ये परिवर्तन, बदले में, पराग की पोषण गुणवत्ता और अंततः लार्वा अवस्था की ऊर्जा वृद्धि को प्रभावित कर सकते हैं। नियंत्रण समूह में देखी गई मृत्यु दर अन्य अध्ययनों 56,57 के अनुरूप थी।
हमारे अध्ययन में देखा गया नर-पक्षपाती लिंगानुपात अपर्याप्त संभोग और पुष्पन के दौरान खराब मौसम की स्थिति जैसे कारकों से समझाया जा सकता है, जैसा कि विसेंस और बॉश द्वारा ओ. कॉर्नुटा के लिए पहले सुझाया गया था। हालाँकि हमारे अध्ययन में मादाओं और नरों के संभोग के लिए चार दिन का समय था (यह अवधि आमतौर पर सफल संभोग के लिए पर्याप्त मानी जाती है), हमने तनाव को कम करने के लिए जानबूझकर प्रकाश की तीव्रता कम कर दी। हालाँकि, यह परिवर्तन अनजाने में संभोग प्रक्रिया में बाधा डाल सकता है61। इसके अलावा, मधुमक्खियाँ कई दिनों तक प्रतिकूल मौसम का अनुभव करती हैं, जिसमें बारिश और कम तापमान (<5°C) शामिल है, जो संभोग की सफलता पर भी नकारात्मक प्रभाव डाल सकता है4,23।
यद्यपि हमारा अध्ययन संपूर्ण लार्वा माइक्रोबायोम पर केंद्रित था, हमारे परिणाम जीवाणु समुदायों के बीच संभावित संबंधों की अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो मधुमक्खी पोषण और कवकनाशी जोखिम के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैन्कोज़ेब-उपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में अनुपचारित पराग खिलाए गए लार्वा की तुलना में सूक्ष्मजीव समुदाय संरचना और प्रचुरता में उल्लेखनीय कमी आई थी। अनुपचारित पराग खाने वाले लार्वा में, जीवाणु समूह प्रोटियोबैक्टीरिया और एक्टिनोबैक्टीरिया प्रमुख थे और मुख्य रूप से वायवीय या ऐच्छिक रूप से वायवीय थे। डेल्फ़्ट जीवाणु, जो आमतौर पर एकान्त मधुमक्खी प्रजातियों से जुड़े होते हैं, में एंटीबायोटिक गतिविधि पाई जाती है, जो रोगजनकों के विरुद्ध एक संभावित सुरक्षात्मक भूमिका का संकेत देती है। एक अन्य जीवाणु प्रजाति, स्यूडोमोनास, अनुपचारित पराग खिलाए गए लार्वा में प्रचुर मात्रा में थी यद्यपि ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य में स्यूडोमोनास की भूमिका के प्रायोगिक प्रमाण का अध्ययन नहीं किया गया है, यह जीवाणु बीटल पैडरस फ्यूसिपेस में सुरक्षात्मक विषाक्त पदार्थों के संश्लेषण को बढ़ावा देता है और इन विट्रो 35, 65 में आर्जिनिन चयापचय को बढ़ावा देता है। ये अवलोकन ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा के विकास काल के दौरान विषाणु और जीवाणु रक्षा में इसकी संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं। माइक्रोबैक्टीरियम हमारे अध्ययन में पहचाना गया एक अन्य वंश है, जो भुखमरी की स्थिति में काली सैनिक मक्खी के लार्वा में बड़ी संख्या में मौजूद पाया गया है66। ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में, माइक्रोबैक्टीरिया तनाव की स्थिति में आंत के माइक्रोबायोम के संतुलन और लचीलेपन में योगदान दे सकते हैं। इसके अतिरिक्त, रोडोकॉकस ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में पाया जाता है और अपनी विषहरण क्षमताओं के लिए जाना जाता है67। यह वंश ए. फ्लोरिया की आंत में भी पाया जाता है, लेकिन बहुत कम मात्रा में68। हमारे परिणाम कई सूक्ष्मजीवी वर्गों में कई आनुवंशिक विविधताओं की उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं जो लार्वा में चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं। हालाँकि, ओ. कॉर्निफ्रॉन्स की कार्यात्मक विविधता की बेहतर समझ की आवश्यकता है।
संक्षेप में, परिणाम दर्शाते हैं कि मैन्कोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन ने शरीर के वज़न में वृद्धि को कम किया और मक्का बोरर लार्वा की मृत्यु दर में वृद्धि की। हालाँकि परागणकों पर कवकनाशियों के प्रभावों के बारे में चिंता बढ़ रही है, फिर भी इन यौगिकों के अवशिष्ट मेटाबोलाइट्स के प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता है। इन परिणामों को एकीकृत परागण प्रबंधन कार्यक्रमों के लिए अनुशंसाओं में शामिल किया जा सकता है जो किसानों को फलों के पेड़ों पर फूल आने से पहले और उसके दौरान कवकनाशियों का चयन करके और उपयोग के समय में बदलाव करके, या कम हानिकारक विकल्पों के उपयोग को प्रोत्साहित करके कुछ कवकनाशियों के उपयोग से बचने में मदद करते हैं। 36 यह जानकारी कीटनाशकों के उपयोग पर अनुशंसाएँ विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि मौजूदा छिड़काव कार्यक्रमों को समायोजित करना और कवकनाशियों का चयन करते समय छिड़काव समय बदलना या कम खतरनाक विकल्पों के उपयोग को बढ़ावा देना। लिंग अनुपात, आहार व्यवहार, आंत माइक्रोबायोम और मक्का बोरर के वज़न घटने और मृत्यु दर के अंतर्निहित आणविक तंत्र पर कवकनाशियों के प्रतिकूल प्रभावों पर और अधिक शोध की आवश्यकता है।
चित्र 1 और 2 में स्रोत डेटा 1, 2 और 3 फ़िगशेयर डेटा रिपॉज़िटरी DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 और https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233 में जमा किए गए हैं। वर्तमान अध्ययन (चित्र 4, 5) में विश्लेषित अनुक्रम NCBI SRA रिपॉज़िटरी में परिग्रहण संख्या PRJNA1023565 के अंतर्गत उपलब्ध हैं।
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