कवकनाशी के पूरक आहार से एकाकी मेसन मधुमक्खियों में शुद्ध ऊर्जा लाभ और माइक्रोबायोम विविधता में कमी आती है।

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फलदार वृक्षों में फूल आने के दौरान अक्सर फफूंदनाशकों का प्रयोग किया जाता है, जिससे कीट परागणकों को खतरा हो सकता है। हालांकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी है कि गैर-मधुमक्खी परागणक (जैसे, एकल मधुमक्खियां, ऑस्मिया कॉर्निफ्रॉन्स) सेब में फूल आने के दौरान आमतौर पर इस्तेमाल होने वाले संपर्क और प्रणालीगत फफूंदनाशकों पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं। इस जानकारी की कमी के कारण फफूंदनाशक छिड़काव की सुरक्षित सांद्रता और समय निर्धारित करने वाले नियामक निर्णय सीमित हो जाते हैं। हमने दो संपर्क फफूंदनाशकों (कैप्टन और मैनकोजेब) और चार अंतरपरत/पादप प्रणाली फफूंदनाशकों (सिप्रोसाइक्लिन, माइक्लोबुटानिल, पायरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) के प्रभावों का आकलन किया। लार्वा के वजन में वृद्धि, उत्तरजीविता, लिंग अनुपात और जीवाणु विविधता पर प्रभावों का अध्ययन किया गया। यह मूल्यांकन एक दीर्घकालिक मौखिक जैव परीक्षण विधि का उपयोग करके किया गया, जिसमें पराग को तीन खुराकों में उपचारित किया गया: वर्तमान में क्षेत्र में उपयोग के लिए अनुशंसित खुराक (1X), आधी खुराक (0.5X) और कम खुराक (0.1X)। मैनकोजेब और पायरिटिसोलिन की सभी खुराकों ने शरीर के वजन और लार्वा की उत्तरजीविता को काफी कम कर दिया। इसके बाद हमने मैनकोज़ेब नामक फफूंदनाशक के लार्वा जीवाणुओं की विशेषताओं का पता लगाने के लिए 16S जीन का अनुक्रमण किया। मैनकोज़ेब से उपचारित पराग पर पलने वाले लार्वा में जीवाणुओं की विविधता और संख्या में उल्लेखनीय कमी पाई गई। हमारे प्रयोगशाला परिणामों से संकेत मिलता है कि पुष्पन के दौरान इनमें से कुछ फफूंदनाशकों का छिड़काव ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य के लिए विशेष रूप से हानिकारक है। यह जानकारी फल वृक्ष संरक्षण उत्पादों के सतत उपयोग से संबंधित भविष्य के प्रबंधन निर्णयों के लिए प्रासंगिक है और परागणकों की सुरक्षा के उद्देश्य से नियामक प्रक्रियाओं का आधार बनती है।
एकल मेसन मधुमक्खी ओस्मिया कॉर्निफ्रॉन्स (हाइमेनोप्टेरा: मेगाचिलिडे) को 1970 के दशक के अंत और 1980 के दशक की शुरुआत में जापान से संयुक्त राज्य अमेरिका में लाया गया था, और तब से यह प्रजाति प्रबंधित पारिस्थितिक तंत्रों में एक महत्वपूर्ण परागणकर्ता की भूमिका निभा रही है। इस मधुमक्खी की प्राकृतिक आबादी लगभग 50 जंगली मधुमक्खी प्रजातियों का हिस्सा है जो संयुक्त राज्य अमेरिका में बादाम और सेब के बागों में परागण करने वाली मधुमक्खियों का पूरक हैं2,3। मेसन मधुमक्खियों को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जिनमें आवास विखंडन, रोगजनक और कीटनाशक शामिल हैं3,4। कीटनाशकों में, फफूंदनाशक ऊर्जा प्राप्ति, चारा खोजने5 और शारीरिक स्थिति6,7 को कम करते हैं। हालांकि हाल के शोध से पता चलता है कि मेसन मधुमक्खियों का स्वास्थ्य सहजीवी और बाह्य सूक्ष्मजीवों से सीधे प्रभावित होता है,8,9 क्योंकि बैक्टीरिया और कवक पोषण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, मेसन मधुमक्खियों की सूक्ष्मजीव विविधता पर फफूंदनाशक के संपर्क के प्रभावों का अध्ययन अभी शुरू ही हुआ है।
सेब की पपड़ी, बिटर रॉट, ब्राउन रॉट और पाउडरी मिल्ड्यू जैसी बीमारियों के उपचार के लिए, फूल आने से पहले और फूल आने के दौरान बागों में विभिन्न प्रभावों (संपर्क और प्रणालीगत) वाले फफूंदनाशकों का छिड़काव किया जाता है।10,11 परागणकों के लिए फफूंदनाशक हानिरहित माने जाते हैं, इसलिए फूल आने की अवधि के दौरान बागवानों को इनका उपयोग करने की सलाह दी जाती है। मधुमक्खियों द्वारा इन फफूंदनाशकों के संपर्क और अंतर्ग्रहण के बारे में अपेक्षाकृत अच्छी जानकारी है, क्योंकि यह अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और कई अन्य राष्ट्रीय नियामक एजेंसियों द्वारा कीटनाशक पंजीकरण प्रक्रिया का हिस्सा है।12,13,14 हालांकि, मधुमक्खियों के अलावा अन्य जीवों पर फफूंदनाशकों के प्रभावों के बारे में कम जानकारी है क्योंकि संयुक्त राज्य अमेरिका में विपणन प्राधिकरण समझौतों के तहत इनकी आवश्यकता नहीं है।15 इसके अलावा, आमतौर पर एकल मधुमक्खियों के परीक्षण के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं हैं।16,17 परीक्षण के लिए मधुमक्खियां उपलब्ध कराने वाली कॉलोनियों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है।18 जंगली मधुमक्खियों पर कीटनाशकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए यूरोप और संयुक्त राज्य अमेरिका में विभिन्न पालतू मधुमक्खियों पर परीक्षण तेजी से किए जा रहे हैं, और हाल ही में ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।19
सींग वाली मधुमक्खियाँ मोनोसाइट होती हैं और व्यावसायिक रूप से कार्प मछली पालन में शहद मधुमक्खियों के पूरक या प्रतिस्थापन के रूप में उपयोग की जाती हैं। ये मधुमक्खियाँ मार्च और अप्रैल के बीच निकलती हैं, जिनमें नर मधुमक्खियाँ मादाओं से तीन से चार दिन पहले निकलती हैं। मैथुन के बाद, मादा सक्रिय रूप से पराग और अमृत एकत्र करती है ताकि नलीदार घोंसले की गुहा (प्राकृतिक या कृत्रिम)1,20 के भीतर कई ब्रूड सेल बना सके। अंडे सेल के अंदर पराग पर दिए जाते हैं; फिर मादा अगले सेल को तैयार करने से पहले मिट्टी की दीवार बनाती है। पहले चरण के लार्वा कोरियन में बंद रहते हैं और भ्रूण के तरल पदार्थों पर भोजन करते हैं। दूसरे से पाँचवें चरण (प्रीप्यूपा) तक, लार्वा पराग पर भोजन करते हैं22। एक बार जब पराग की आपूर्ति पूरी तरह से समाप्त हो जाती है, तो लार्वा कोकून बनाते हैं, प्यूपा में परिवर्तित होते हैं और उसी ब्रूड कक्ष में वयस्क के रूप में निकलते हैं, आमतौर पर देर से गर्मियों में20,23। वयस्क अगले वसंत में निकलते हैं। वयस्क का जीवित रहना भोजन सेवन के आधार पर शुद्ध ऊर्जा लाभ (वजन वृद्धि) से जुड़ा होता है। इस प्रकार, पराग की पोषण गुणवत्ता, साथ ही मौसम या कीटनाशकों के संपर्क जैसे अन्य कारक, जीवन और स्वास्थ्य के निर्धारक हैं24।
फूल आने से पहले प्रयोग किए जाने वाले कीटनाशक और फफूंदनाशक पौधे की संवहनी प्रणाली में अलग-अलग मात्रा में प्रवेश कर सकते हैं, जैसे कि आच्छादकीय (उदाहरण के लिए, पत्तियों की ऊपरी सतह से निचली सतह तक जाने में सक्षम, जैसे कुछ फफूंदनाशक) 25 से लेकर पूर्णतः प्रणालीगत प्रभाव तक। , जो जड़ों से तने में प्रवेश कर सकते हैं, सेब के फूलों के अमृत में प्रवेश कर सकते हैं26, जहां वे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन्स को मार सकते हैं27। कुछ कीटनाशक पराग में भी रिस जाते हैं, जिससे मक्का के लार्वा का विकास प्रभावित होता है और उनकी मृत्यु हो जाती है19। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि कुछ फफूंदनाशक संबंधित प्रजाति ओ. लिग्नारिया28 के घोंसला बनाने के व्यवहार को महत्वपूर्ण रूप से बदल सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कीटनाशक जोखिम परिदृश्यों (फफूंदनाशकों सहित) का अनुकरण करने वाले प्रयोगशाला और क्षेत्र अध्ययनों से पता चला है कि कीटनाशक मधुमक्खियों और कुछ एकाकी मधुमक्खियों की शारीरिक क्रिया विज्ञान 22, आकारिकी 29 और उत्तरजीविता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। पुष्पन के दौरान खुले फूलों पर सीधे लगाए जाने वाले विभिन्न फफूंदनाशक स्प्रे, लार्वा विकास के लिए वयस्कों द्वारा एकत्र किए गए पराग को दूषित कर सकते हैं, जिसके प्रभावों का अध्ययन किया जाना बाकी है30।
यह बात अब सर्वविदित हो रही है कि लार्वा का विकास परागकणों और पाचन तंत्र के सूक्ष्मजीव समुदायों से प्रभावित होता है। मधुमक्खी का माइक्रोबायोम शरीर के द्रव्यमान³¹, चयापचय संबंधी परिवर्तनों²² और रोगजनकों के प्रति संवेदनशीलता³² जैसे मापदंडों को प्रभावित करता है। पिछले अध्ययनों में एकल मधुमक्खियों के माइक्रोबायोम पर विकास के चरण, पोषक तत्वों और पर्यावरण के प्रभाव का अध्ययन किया गया है। इन अध्ययनों से एकल मधुमक्खी प्रजातियों के बीच लार्वा और परागकण माइक्रोबायोम³³ की संरचना और प्रचुरता के साथ-साथ सबसे आम जीवाणु वंश स्यूडोमोनास और डेल्फ़्टिया में समानताएं सामने आईं। हालांकि, कवकनाशी को मधुमक्खी स्वास्थ्य की रक्षा के उपायों से जोड़ा गया है, लेकिन प्रत्यक्ष मौखिक संपर्क के माध्यम से लार्वा माइक्रोबायोटा पर कवकनाशी के प्रभावों का अभी तक अध्ययन नहीं किया गया है।
इस अध्ययन में संयुक्त राज्य अमेरिका में वृक्ष फलों पर उपयोग के लिए पंजीकृत छह सामान्य रूप से प्रयुक्त फफूंदनाशकों की वास्तविक खुराक के प्रभावों का परीक्षण किया गया, जिनमें दूषित भोजन से कॉर्न हॉर्नवर्म मोथ लार्वा को मौखिक रूप से दिए गए संपर्क और प्रणालीगत फफूंदनाशक शामिल थे। हमने पाया कि संपर्क और प्रणालीगत फफूंदनाशकों ने मधुमक्खियों के शारीरिक वजन में वृद्धि को कम किया और मृत्यु दर को बढ़ाया, जिसमें मैनकोजेब और पाइरिथियोपाइड के साथ सबसे गंभीर प्रभाव देखे गए। इसके बाद हमने मैनकोजेब-उपचारित पराग आहार पर पाले गए लार्वा की सूक्ष्मजीव विविधता की तुलना नियंत्रण आहार पर पाले गए लार्वा से की। हम मृत्यु दर के अंतर्निहित संभावित तंत्रों और एकीकृत कीट एवं परागणकर्ता प्रबंधन (IPPM)36 कार्यक्रमों के लिए निहितार्थों पर चर्चा करते हैं।
कोकून में शीतनिद्रा कर रहे वयस्क ओ. कॉर्निफ्रॉन्स को फल अनुसंधान केंद्र, बिग्लरविल, पेंसिल्वेनिया से प्राप्त किया गया और प्रयोग से पहले -3 से 2 डिग्री सेल्सियस (±0.3 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहित किया गया (कुल 600 कोकून)। मई 2022 में, 100 ओ. कॉर्निफ्रॉन्स कोकून को प्रतिदिन प्लास्टिक के कपों में स्थानांतरित किया गया (प्रत्येक कप में 50 कोकून, व्यास 5 सेमी × 15 सेमी लंबा) और कपों के अंदर वाइप्स रखे गए ताकि कोकून आसानी से खुल सकें और चबाने योग्य सतह मिल सके, जिससे पथरीली मधुमक्खियों पर तनाव कम हो सके।37 कोकून युक्त दो प्लास्टिक कपों को एक कीट पिंजरे (30 × 30 × 30 सेमी, बगडॉर्म मेगाव्यू साइंस कंपनी लिमिटेड, ताइवान) में 10 मिलीलीटर फीडर के साथ रखा गया जिसमें 50% सुक्रोज घोल था और कोकून के बंद होने और मैथुन सुनिश्चित करने के लिए चार दिनों तक रखा गया। 23°C, सापेक्ष आर्द्रता 60%, प्रकाश अवधि 10 लीटर (कम तीव्रता): 14 दिन। सेब के फूल आने के चरम समय के दौरान, छह दिनों तक प्रतिदिन 100 मादा और नर पक्षियों को दो कृत्रिम घोंसलों में छोड़ा गया (जालनुमा घोंसला: चौड़ाई 33.66 × ऊंचाई 30.48 × लंबाई 46.99 सेमी; अनुपूरक चित्र 1)। पेंसिल्वेनिया स्टेट आर्बोरेटम में, चेरी (प्रूनस सेरासस 'यूबैंक' स्वीट चेरी पाई™), आड़ू (प्रूनस पर्सिका 'कंटेंडर'), प्रूनस पर्सिका 'पीएफ 27ए' फ्लेमिन फ्यूरी®), नाशपाती (पाइरस पेरिफोलिया 'ओलंपिक', पाइरस पेरिफोलिया 'शिंको', पाइरस पेरिफोलिया 'शिनसेकी'), कोरोनारिया सेब का पेड़ (मालस कोरोनारिया) और सेब के पेड़ों की कई किस्में (मालस कोरोनारिया, मालस), घरेलू सेब का पेड़ 'को-ऑप 30' एंटरप्राइज™, मालस सेब का पेड़ 'को-ऑप 31' वाइनक्रिसप™, बेगोनिया 'फ्रीडम', बेगोनिया 'गोल्डन डिलीशियस', बेगोनिया 'नोवा स्पाई' के पास स्थित है। प्रत्येक नीले प्लास्टिक के पक्षीघर को दो लकड़ी के बक्सों के ऊपर रखा जा सकता है। प्रत्येक घोंसले के डिब्बे में 800 खाली क्राफ्ट पेपर ट्यूब (सर्पिल खुला, 0.8 सेमी आईडी × 15 सेमी एल) (जोन्सविले पेपर ट्यूब कंपनी, मिशिगन) अपारदर्शी सेलोफेन ट्यूबों (0.7 ओडी देखें) में डाले गए थे। प्लास्टिक प्लग (टी-1एक्स प्लग) घोंसले बनाने की जगह प्रदान करते हैं।
दोनों घोंसले के बक्से पूर्व दिशा की ओर थे और चूहों और पक्षियों की पहुँच को रोकने के लिए हरे प्लास्टिक की बाड़ (एवरबिल्ट मॉडल #889250EB12, खुलने का आकार 5 × 5 सेमी, 0.95 मीटर × 100 मीटर) से ढके हुए थे। इन्हें घोंसले के बक्सों के बगल में मिट्टी की सतह पर रखा गया था। (पूरक चित्र 1a)। मक्का छेदक कीट के अंडे प्रतिदिन घोंसलों से 30 नलिकाएँ एकत्र करके प्रयोगशाला में लाए गए। कैंची से नलिका के सिरे पर एक कट लगाया गया, फिर सर्पिल नलिका को अलग करके चूजों की कोशिकाओं को निकाला गया। घुमावदार स्पैटुला (माइक्रोस्लाइड टूल किट, बायोक्विप प्रोडक्ट्स इंक., कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके प्रत्येक अंडे और उनके पराग को अलग किया गया। अंडों को नम फ़िल्टर पेपर पर रखा गया और प्रयोगों में उपयोग करने से पहले 2 घंटे के लिए पेट्री डिश में रखा गया (पूरक चित्र 1b-d)।
प्रयोगशाला में, हमने सेब के फूल आने से पहले और उसके दौरान तीन सांद्रताओं (0.1X, 0.5X और 1X, जहाँ 1X प्रति 100 गैलन पानी/एकड़ में प्रयुक्त मात्रा है। उच्च क्षेत्र खुराक = खेत में सांद्रता) पर प्रयोग किए गए छह फफूंदनाशकों की मौखिक विषाक्तता का मूल्यांकन किया (तालिका 1)। प्रत्येक सांद्रता को 16 बार दोहराया गया (n = 16)। दो संपर्क फफूंदनाशकों (तालिका S1: मैनकोजेब 2696.14 पीपीएम और कैप्टन 2875.88 पीपीएम) और चार प्रणालीगत फफूंदनाशकों (तालिका S1: पाइरिथियोस्ट्रोबिन 250.14 पीपीएम; ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन 110.06 पीपीएम; माइक्लोबुटानिल एजोल 75.12 पीपीएम; साइप्रोडिनिल 280.845 पीपीएम) की फलों, सब्जियों और सजावटी फसलों पर विषाक्तता का अध्ययन किया गया। हमने परागकणों को ग्राइंडर से पीसकर समरूप बनाया, 0.20 ग्राम परागकण एक कुएं (24-वेल फाल्कन प्लेट) में स्थानांतरित किया, और उसमें 1 माइक्रोलीटर फफूंदनाशक घोल मिलाकर पिरामिडनुमा परागकण बनाया जिसमें 1 मिमी गहरे कुएं थे, जिनमें अंडे रखे गए। अंडों को एक मिनी स्पैटुला की सहायता से रखा गया (पूरक चित्र 1c,d)। फाल्कन प्लेटों को कमरे के तापमान (25°C) और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर संग्रहित किया गया। हमने इनकी तुलना उन नियंत्रण लार्वा से की जिन्हें शुद्ध जल से उपचारित समरूप परागकण आहार दिया गया था। हमने मृत्यु दर दर्ज की और लार्वा के वजन को हर दूसरे दिन तब तक मापा जब तक कि वे पूर्व-प्यूपा अवस्था तक नहीं पहुंच गए, इसके लिए हमने एक विश्लेषणात्मक तराजू (फिशर साइंटिफिक, सटीकता = 0.0001 ग्राम) का उपयोग किया। अंत में, 2.5 महीने बाद कोकून को खोलकर लिंग अनुपात का आकलन किया गया।
संपूर्ण ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा (प्रत्येक उपचार स्थिति के लिए n = 3, मैनकोज़ेब-उपचारित और अनुपचारित पराग) से डीएनए निकाला गया और हमने इन नमूनों पर सूक्ष्मजीव विविधता विश्लेषण किया, विशेष रूप से इसलिए क्योंकि मैनकोज़ेब में MnZn प्राप्त करने वाले लार्वा में सबसे अधिक मृत्यु दर देखी गई थी। डीएनए को DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके प्रवर्धित और शुद्ध किया गया, और v3 किट का उपयोग करके इलुमिना® MiSeq™ पर अनुक्रमित (600 चक्र) किया गया। जीवाणु 16S राइबोसोमल आरएनए जीन का लक्षित अनुक्रमण क्विक-16S™ NGS लाइब्रेरी प्रेप किट (ज़ाइमो रिसर्च, इरविन, कैलिफ़ोर्निया) का उपयोग करके 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को लक्षित करने वाले प्राइमर के साथ किया गया। इसके अतिरिक्त, 10% PhiX समावेशन का उपयोग करके 18S अनुक्रमण किया गया, और प्राइमर जोड़ी 18S001 और NS4 का उपयोग करके प्रवर्धन किया गया।
QIIME2 पाइपलाइन (v2022.11.1) का उपयोग करके युग्मित रीड्स39 को आयात और संसाधित किया गया। इन रीड्स को ट्रिम और मर्ज किया गया, और QIIME2 (qiime dada2 noise pairing)40 में DADA2 प्लगइन का उपयोग करके काइमेरिक अनुक्रमों को हटा दिया गया। 16S और 18S वर्ग असाइनमेंट ऑब्जेक्ट क्लासिफायर प्लगइन Classify-sklearn और पूर्व-प्रशिक्षित आर्टिफैक्ट silva-138-99-nb-classifier का उपयोग करके किए गए।
सभी प्रायोगिक डेटा की सामान्यता (शपिरो-विल्क्स) और प्रसरण की समरूपता (लेवेन परीक्षण) की जाँच की गई। चूंकि डेटा सेट पैरामीट्रिक विश्लेषण की मान्यताओं को पूरा नहीं करता था और रूपांतरण अवशिष्टों को मानकीकृत करने में विफल रहा, इसलिए हमने लार्वा के ताजे वजन पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए दो कारकों [समय (तीन चरण 2, 5 और 8 दिन के समय बिंदु) और फफूंदनाशक] के साथ एक गैर-पैरामीट्रिक दो-तरफ़ा एनोवा (क्रुस्कल-वालिस) किया, फिर विल्कोक्सन परीक्षण का उपयोग करके पोस्ट हॉक गैर-पैरामीट्रिक जोड़ीदार तुलनाएँ की गईं। हमने तीन फफूंदनाशक सांद्रता41,42 में उत्तरजीविता पर फफूंदनाशकों के प्रभावों की तुलना करने के लिए पॉइसन वितरण के साथ एक सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (जीएलएम) का उपयोग किया। विभेदक प्रचुरता विश्लेषण के लिए, एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (एएसवी) की संख्या को जीनस स्तर पर समेकित किया गया। समूहों के बीच विभेदक प्रचुरता की तुलना 16S (जीनस स्तर) और 18S सापेक्ष प्रचुरता का उपयोग करके, बीटा ज़ीरो-इन्फ़्लेटेड (BEZI) परिवार वितरण के साथ स्थिति, पैमाने और आकार (GAMLSS) के लिए एक सामान्यीकृत योगात्मक मॉडल का उपयोग करके की गई, जिसे माइक्रोबायोम R43 (v1.1) में एक मैक्रो पर मॉडल किया गया था। 1). विभेदक विश्लेषण से पहले माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट प्रजातियों को हटा दें। 18S के विभिन्न वर्गीकरण स्तरों के कारण, विभेदक विश्लेषण के लिए प्रत्येक टैक्सोन के केवल सबसे निचले स्तर का उपयोग किया गया था। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण R (v. 3.4.3., CRAN प्रोजेक्ट) (टीम 2013) का उपयोग करके किए गए थे।
मैनकोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के संपर्क में आने से ओ. कॉर्निफ्रॉन्स में शारीरिक वजन में वृद्धि काफी कम हो गई (चित्र 1)। ये प्रभाव तीनों ही मात्राओं पर समान रूप से देखे गए (चित्र 1a–c)। साइक्लोस्ट्रोबिन और माइक्लोबुटानिल ने लार्वा के वजन में कोई खास कमी नहीं की।
चार आहार उपचारों (समरूप पराग फ़ीड + फफूंदनाशक: नियंत्रण, 0.1X, 0.5X और 1X खुराक) के तहत तीन समय बिंदुओं पर मापा गया तना छेदक लार्वा का औसत ताजा वजन। (a) कम खुराक (0.1X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 30.99, DF = 6; P < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): 22.83, DF = 0.0009; तीसरा समय बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; (b) आधी खुराक (0.5X): पहला समय बिंदु (दिन 1): χ2: 35.67, DF = 6; P < 0.0001, दूसरा समय बिंदु (दिन 1): χ2: 15.98, DF = 6; P = 0.0090; तीसरा समय बिंदु (दिन 8) χ2: 16.47, DF = 6; (c) साइट या पूर्ण खुराक (1X): पहला समय बिंदु (दिन 1) χ2: 20.64, P = 6; P = 0.0326, दूसरा समय बिंदु (दिन 5): χ2: 22.83, DF = 6; P = 0.0009; तीसरा समय बिंदु (दिन 8): χ2: 28.39, DF = 6; गैर-पैरामीट्रिक विश्लेषण। बार युग्मवार तुलनाओं के माध्य ± SE को दर्शाते हैं (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001।
सबसे कम खुराक (0.1X) पर, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के साथ लार्वा के शरीर के वजन में 60% की कमी आई, मैनकोजेब के साथ 49%, माइक्लोबुटानिल के साथ 48% और पाइरिथियोस्ट्रोबिन के साथ 46% की कमी आई (चित्र 1a)। जब इन्हें आधी खुराक (0.5X) के संपर्क में लाया गया, तो मैनकोजेब लार्वा के शरीर के वजन में 86% की कमी आई, पाइरिथियोस्ट्रोबिन के साथ 52% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के साथ 50% की कमी आई (चित्र 1b)। मैनकोजेब की पूरी खुराक (1X) से लार्वा के वजन में 82% की कमी आई, पाइरिथियोस्ट्रोबिन के साथ 70% और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन, माइक्लोबुटानिल और संगार्ड के साथ लगभग 30% की कमी आई (चित्र 1c)।
मैनकोज़ेब से उपचारित पराग से पोषित लार्वा में मृत्यु दर सबसे अधिक थी, उसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन से उपचारित लार्वा में मृत्यु दर अधिक थी। मैनकोज़ेब और पाइरिटिसोलिन की खुराक बढ़ने के साथ मृत्यु दर भी बढ़ी (चित्र 2; तालिका 2)। हालांकि, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन की सांद्रता बढ़ने पर कॉर्न बोरर की मृत्यु दर में मामूली वृद्धि हुई; साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में मृत्यु दर में कोई खास वृद्धि नहीं की।
छह अलग-अलग फफूंदनाशकों से उपचारित पराग के सेवन के बाद मक्खी के लार्वा की मृत्यु दर की तुलना की गई। मैनकोज़ेब और पेंटोपाइरामाइड मक्के के लार्वा के मौखिक संपर्क के प्रति अधिक संवेदनशील थे (जीएलएम: χ = 29.45, डीएफ = 20, पी = 0.0059) (रेखा, ढलान = 0.29, पी < 0.001; ढलान = 0.24, पी < 0.00)।
सभी उपचारों में औसतन 39.05% रोगी महिलाएं और 60.95% पुरुष थे। नियंत्रण उपचारों में, कम खुराक (0.1X) और आधी खुराक (0.5X) दोनों अध्ययनों में महिलाओं का अनुपात 40% था, और क्षेत्र-खुराक (1X) अध्ययनों में 30% था। 0.1X खुराक पर, मैनकोज़ेब और माइक्लोबुटानिल से उपचारित पराग-पोषित लार्वा में, 33.33% वयस्क मादा थे, 22% वयस्क मादा थे, 44% वयस्क लार्वा मादा थे, 41% वयस्क लार्वा मादा थे, और नियंत्रण समूह में यह अनुपात 31% था (चित्र 3a)। 0.5 गुना खुराक पर, मैनकोज़ेब और पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 33% वयस्क कृमि मादा थे, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 36%, माइक्लोबुटानिल समूह में 41% और साइप्रोस्ट्रोबिन समूह में 46% थे। कैप्टन समूह में यह आंकड़ा 53% और नियंत्रण समूह में 38% था (चित्र 3b)। 1 गुना खुराक पर, मैनकोज़ेब समूह में 30% मादा, पाइरिथियोस्ट्रोबिन समूह में 36%, ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन समूह में 44%, माइक्लोबुटानिल समूह में 38% और नियंत्रण समूह में 50% मादा थे (चित्र 3c)।
लार्वा अवस्था में फफूंदनाशक के संपर्क में आने के बाद मादा और नर कीटों का प्रतिशत। (a) कम खुराक (0.1X)। (b) आधी खुराक (0.5X)। (c) खेत में दी जाने वाली खुराक या पूरी खुराक (1X)।
16S अनुक्रम विश्लेषण से पता चला कि मैनकोज़ेब-उपचारित पराग से पोषित लार्वा और अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा के जीवाणु समूह में अंतर था (चित्र 4a)। अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा का सूक्ष्मजीव सूचकांक मैनकोज़ेब-उपचारित पराग से पोषित लार्वा की तुलना में अधिक था (चित्र 4b)। यद्यपि समूहों के बीच विविधता में देखा गया अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, फिर भी यह अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा की तुलना में काफी कम था (चित्र 4c)। सापेक्ष प्रचुरता से पता चला कि नियंत्रित पराग से पोषित लार्वा का सूक्ष्मजीव समूह मैनकोज़ेब-उपचारित लार्वा से पोषित लार्वा की तुलना में अधिक विविध था (चित्र 5a)। वर्णनात्मक विश्लेषण से नियंत्रित और मैनकोज़ेब-उपचारित नमूनों में 28 वंशों की उपस्थिति का पता चला (चित्र 5b)। 18S अनुक्रमण का उपयोग करके किए गए विश्लेषण में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया (पूरक चित्र 2)।
16S अनुक्रमों पर आधारित SAV प्रोफाइल की तुलना शैनन समृद्धि और संघ स्तर पर प्रेक्षित समृद्धि से की गई। (a) अनुपचारित पराग-पोषित या नियंत्रण (नीला) और मैनकोज़ेब-पोषित लार्वा (नारंगी) में समग्र सूक्ष्मजीव समुदाय संरचना पर आधारित प्रमुख समन्वय विश्लेषण (PCoA)। प्रत्येक डेटा बिंदु एक अलग नमूने का प्रतिनिधित्व करता है। PCoA की गणना बहुभिन्नरूपी t वितरण की ब्रे-कर्टिस दूरी का उपयोग करके की गई थी। अंडाकार 80% विश्वास स्तर को दर्शाते हैं। (b) बॉक्सप्लॉट, कच्चा शैनन धन डेटा (बिंदु) और (c) प्रेक्षित धन। बॉक्सप्लॉट माध्यिका रेखा, अंतरचतुर्थक सीमा (IQR), और 1.5 × IQR (n = 3) के लिए बॉक्स दिखाते हैं।
मैनकोज़ेब से उपचारित और अनुपचारित पराग पर पलने वाले लार्वा के सूक्ष्मजीव समुदायों की संरचना। (a) लार्वा में सूक्ष्मजीव वंशों की सापेक्ष बहुलता। (b) पहचाने गए सूक्ष्मजीव समुदायों का हीट मैप। डेल्फ़्टिया (ऑड्स अनुपात (OR) = 0.67, P = 0.0030) और स्यूडोमोनास (OR = 0.3, P = 0.0074), माइक्रोबैक्टीरियम (OR = 0.75, P = 0.0617) (OR = 1.5, P = 0.0060); हीट मैप की पंक्तियों को सहसंबंध दूरी और औसत कनेक्टिविटी का उपयोग करके क्लस्टर किया गया है।
हमारे परिणामों से पता चलता है कि पुष्पन के दौरान व्यापक रूप से प्रयोग किए जाने वाले संपर्क (मैनकोज़ेब) और प्रणालीगत (पायरोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन) फफूंदनाशकों के मौखिक सेवन से मक्के के लार्वा के वजन में उल्लेखनीय कमी आई और मृत्यु दर में वृद्धि हुई। इसके अलावा, मैनकोज़ेब ने पूर्व-प्यूपा अवस्था के दौरान माइक्रोबायोम की विविधता और प्रचुरता को काफी कम कर दिया। एक अन्य प्रणालीगत फफूंदनाशक, माइक्लोबुटानिल ने तीनों खुराकों पर लार्वा के शारीरिक वजन में उल्लेखनीय कमी की। यह प्रभाव दूसरे (दिन 5) और तीसरे (दिन 8) समय बिंदुओं पर स्पष्ट था। इसके विपरीत, साइप्रोडिनिल और कैप्टन ने नियंत्रण समूह की तुलना में वजन में वृद्धि या जीवित रहने की दर में कोई उल्लेखनीय कमी नहीं की। हमारी जानकारी के अनुसार, यह अध्ययन प्रत्यक्ष पराग संपर्क के माध्यम से मक्का की फसलों की सुरक्षा के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न फफूंदनाशकों की क्षेत्र दरों के प्रभावों को निर्धारित करने वाला पहला अध्ययन है।
सभी फफूंदनाशक उपचारों ने नियंत्रण उपचारों की तुलना में शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी की। मैनकोज़ेब का लार्वा के शरीर के वजन में वृद्धि पर सबसे अधिक प्रभाव पड़ा, जिसमें औसतन 51% की कमी देखी गई, इसके बाद पाइरिथियोस्ट्रोबिन का प्रभाव रहा। हालांकि, अन्य अध्ययनों में लार्वा अवस्थाओं पर फफूंदनाशकों की क्षेत्र खुराक के प्रतिकूल प्रभावों की रिपोर्ट नहीं की गई है44। हालांकि डाइथियोकार्बामेट जैवनाशकों में कम तीव्र विषाक्तता पाई गई है45, एथिलीन बिसडाइथियोकार्बामेट (ईबीडीसीएस) जैसे कि मैनकोज़ेब यूरिया एथिलीन सल्फाइड में विघटित हो सकते हैं। अन्य जानवरों में इसके उत्परिवर्तनकारी प्रभावों को देखते हुए, यह विघटन उत्पाद देखे गए प्रभावों के लिए जिम्मेदार हो सकता है46,47। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एथिलीन थायोयूरिया का निर्माण उच्च तापमान48, आर्द्रता स्तर49 और उत्पाद भंडारण की अवधि50 जैसे कारकों से प्रभावित होता है। जैवनाशकों के लिए उचित भंडारण स्थितियां इन दुष्प्रभावों को कम कर सकती हैं। इसके अलावा, यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण ने पाइरिथियोपाइड की विषाक्तता के बारे में चिंता व्यक्त की है, जिसे अन्य जानवरों के पाचन तंत्र के लिए कैंसरकारी दिखाया गया है51।
मैनकोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन के मौखिक सेवन से मक्का छेदक कीट के लार्वा की मृत्यु दर बढ़ जाती है। इसके विपरीत, माइक्लोबुटानिल, सिप्रोसाइक्लिन और कैप्टन का मृत्यु दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ये परिणाम लाडर्नर एट अल.52 के परिणामों से भिन्न हैं, जिन्होंने दिखाया कि कैप्टन ने वयस्क ओ. लिग्नारिया और एपिस मेलिफेरा एल. (हाइमेनोप्टेरा, एपिसिडे) के जीवित रहने की दर को काफी कम कर दिया। इसके अलावा, कैप्टन और बोस्केलिड जैसे कवकनाशी लार्वा की मृत्यु दर52,53,54 या उनके भोजन व्यवहार में परिवर्तन55 का कारण बनते पाए गए हैं। ये परिवर्तन, बदले में, पराग की पोषण गुणवत्ता और अंततः लार्वा अवस्था की ऊर्जा प्राप्ति को प्रभावित कर सकते हैं। नियंत्रण समूह में देखी गई मृत्यु दर अन्य अध्ययनों56,57 के अनुरूप थी।
हमारे अध्ययन में नर-प्रधान लिंग अनुपात को अपर्याप्त संभोग और पुष्पन के दौरान खराब मौसम जैसी स्थितियों से समझाया जा सकता है, जैसा कि पहले ओ. कॉर्नुटा के लिए विसेंस और बॉश द्वारा सुझाया गया था। यद्यपि हमारे अध्ययन में मादा और नर को संभोग के लिए चार दिन मिले (एक अवधि जिसे आमतौर पर सफल संभोग के लिए पर्याप्त माना जाता है), हमने तनाव को कम करने के लिए जानबूझकर प्रकाश की तीव्रता कम कर दी। हालांकि, यह संशोधन अनजाने में संभोग प्रक्रिया में बाधा डाल सकता है61। इसके अलावा, मधुमक्खियों को कई दिनों तक प्रतिकूल मौसम का सामना करना पड़ता है, जिसमें बारिश और कम तापमान (<5°C) शामिल हैं, जो संभोग की सफलता पर भी नकारात्मक प्रभाव डाल सकते हैं4,23।
हालांकि हमारे अध्ययन का ध्यान संपूर्ण लार्वा माइक्रोबायोम पर केंद्रित था, फिर भी हमारे परिणाम जीवाणु समुदायों के बीच संभावित संबंधों की जानकारी प्रदान करते हैं जो मधुमक्खी के पोषण और फफूंदनाशक के संपर्क के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैनकोज़ेब-उपचारित पराग से पोषित लार्वा में अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा की तुलना में सूक्ष्मजीव समुदाय संरचना और प्रचुरता में उल्लेखनीय कमी देखी गई। अनुपचारित पराग का सेवन करने वाले लार्वा में, प्रोटियोबैक्टीरिया और एक्टिनोबैक्टीरिया जीवाणु समूह प्रमुख थे और मुख्य रूप से वायवीय या आंशिक रूप से वायवीय थे। डेल्फ़्ट बैक्टीरिया, जो आमतौर पर एकाकी मधुमक्खी प्रजातियों से जुड़े होते हैं, में एंटीबायोटिक गतिविधि पाई जाती है, जो रोगजनकों के खिलाफ संभावित सुरक्षात्मक भूमिका का संकेत देती है। एक अन्य जीवाणु प्रजाति, स्यूडोमोनास, अनुपचारित पराग से पोषित लार्वा में प्रचुर मात्रा में पाई गई, लेकिन मैनकोज़ेब-उपचारित लार्वा में इसकी मात्रा में उल्लेखनीय कमी आई। हमारे परिणाम पिछले अध्ययनों का समर्थन करते हैं जिनमें स्यूडोमोनास को ओ. बिकोर्निस35 और अन्य एकाकी ततैया34 में सबसे प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले जेनेरा में से एक के रूप में पहचाना गया है। हालांकि ओ. कॉर्निफ्रॉन्स के स्वास्थ्य में स्यूडोमोनास की भूमिका के लिए प्रयोगात्मक प्रमाणों का अध्ययन नहीं किया गया है, लेकिन यह जीवाणु बीटल पैडेरस फ्यूसिप्स में सुरक्षात्मक विषाक्त पदार्थों के संश्लेषण को बढ़ावा देने और इन विट्रो में आर्जिनिन चयापचय को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है 35, 65। ये अवलोकन ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा के विकास के दौरान वायरल और बैक्टीरियल रक्षा में संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं। माइक्रोबैक्टीरियम हमारे अध्ययन में पहचाना गया एक अन्य जीनस है जो भुखमरी की स्थिति में ब्लैक सोल्जर फ्लाई लार्वा में उच्च संख्या में मौजूद होने की सूचना है 66। ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में, माइक्रोबैक्टीरिया तनाव की स्थिति में आंत माइक्रोबायोम के संतुलन और लचीलेपन में योगदान कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, रोडोकोकस ओ. कॉर्निफ्रॉन्स लार्वा में पाया जाता है और अपनी विषहरण क्षमताओं के लिए जाना जाता है 67। यह जीनस ए. फ्लोरिया की आंत में भी पाया जाता है, लेकिन बहुत कम मात्रा में 68। हमारे परिणाम कई सूक्ष्मजीव टैक्सोन में कई आनुवंशिक विविधताओं की उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं जो लार्वा में चयापचय प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं। हालांकि, ओ. कॉर्निफ्रॉन्स की कार्यात्मक विविधता की बेहतर समझ की आवश्यकता है।
संक्षेप में, परिणामों से पता चलता है कि मैनकोज़ेब, पाइरिथियोस्ट्रोबिन और ट्राइफ्लोक्सीस्ट्रोबिन ने मक्का छेदक लार्वा के शारीरिक वजन में वृद्धि को कम किया और उनकी मृत्यु दर को बढ़ा दिया। हालांकि परागणकों पर फफूंदनाशकों के प्रभावों को लेकर चिंता बढ़ रही है, फिर भी इन यौगिकों के अवशिष्ट चयापचयों के प्रभावों को बेहतर ढंग से समझना आवश्यक है। इन परिणामों को एकीकृत परागणक प्रबंधन कार्यक्रमों के लिए सिफारिशों में शामिल किया जा सकता है, जो किसानों को फलदार वृक्षों में फूल आने से पहले और उसके दौरान कुछ फफूंदनाशकों के उपयोग से बचने में मदद करते हैं। इसके लिए वे फफूंदनाशकों का चयन और उनके प्रयोग के समय में बदलाव कर सकते हैं, या कम हानिकारक विकल्पों के उपयोग को प्रोत्साहित कर सकते हैं। 36 यह जानकारी कीटनाशक उपयोग पर सिफारिशें विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि फफूंदनाशकों का चयन करते समय मौजूदा स्प्रे कार्यक्रमों को समायोजित करना और स्प्रे के समय में बदलाव करना, या कम खतरनाक विकल्पों के उपयोग को बढ़ावा देना। लिंग अनुपात, भोजन व्यवहार, आंत माइक्रोबायोम और मक्का छेदक के वजन में कमी और मृत्यु दर के अंतर्निहित आणविक तंत्रों पर फफूंदनाशकों के प्रतिकूल प्रभावों पर आगे शोध की आवश्यकता है।
चित्र 1 और 2 में स्रोत डेटा 1, 2 और 3 को figshare डेटा रिपॉजिटरी में जमा कर दिया गया है (DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 और https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233)। वर्तमान अध्ययन में विश्लेषण किए गए अनुक्रम (चित्र 4, 5) NCBI SRA रिपॉजिटरी में अभिगम संख्या PRJNA1023565 के अंतर्गत उपलब्ध हैं।
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