चीड़ के पेड़ों में नेमाटोड रोग उत्पन्न करने वाले कारकों के रूप में आयोडीन और एवरमेक्टिन का मूल्यांकन

पाइन नेमाटोड एक संगरोधी प्रवासी अंतःपरजीवी है जो पाइन वन पारिस्थितिकी तंत्र में गंभीर आर्थिक नुकसान का कारण बनता है। प्रस्तुत अध्ययन पाइन नेमाटोड के विरुद्ध हैलोजेनयुक्त इंडोल की नेमाटोडनाशक गतिविधि और उनकी क्रियाविधि की समीक्षा करता है। पाइन नेमाटोड के विरुद्ध 5-आयोडोइंडोल और एवरमेक्टिन (सकारात्मक नियंत्रण) की नेमाटोडनाशक गतिविधियाँ समान थीं और कम सांद्रता (10 μg/mL) पर उच्च थीं। 5-आयोडोइंडोल ने प्रजनन क्षमता, प्रजनन गतिविधि, भ्रूण और लार्वा मृत्यु दर और गति व्यवहार को कम किया। अकशेरुकी-विशिष्ट ग्लूटामेट-गेटेड क्लोराइड चैनल रिसेप्टर्स के साथ लिगैंड्स की आणविक अंतःक्रियाएँ इस धारणा का समर्थन करती हैं कि 5-आयोडोइंडोल, एवरमेक्टिन की तरह, रिसेप्टर सक्रिय स्थल से मजबूती से बंधता है। 5-आयोडोइंडोल ने नेमाटोड में विभिन्न प्रकार के शारीरिक विरूपण भी उत्पन्न किए, जिनमें असामान्य अंग संकुचन/सिकुड़न और वैक्यूओलाइजेशन में वृद्धि शामिल है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि वैक्यूल्स नेमाटोड की मिथाइलेशन-प्रेरित मृत्यु में भूमिका निभा सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि 5-आयोडोइंडोल दोनों पौधों (पत्तागोभी और मूली) के लिए विषैला नहीं था। इस प्रकार, यह अध्ययन दर्शाता है कि पर्यावरणीय परिस्थितियों में आयोडोइंडोल का प्रयोग चीड़ के मुरझाने से होने वाली क्षति को नियंत्रित कर सकता है।
पाइन वुड नेमाटोड (बर्साफेलेनचस ज़ाइलोफिलस) पाइन वुड नेमाटोड (पीडब्ल्यूएन) परिवार से संबंधित है, जो प्रवासी अंतःपरजीवी नेमाटोड हैं और पाइन वन पारिस्थितिकी तंत्र को गंभीर पारिस्थितिक क्षति पहुँचाने के लिए जाने जाते हैं।¹ पाइन वुड नेमाटोड के कारण होने वाला पाइन विल्ट रोग (पीडब्ल्यूडी) एशिया और यूरोप सहित कई महाद्वीपों में एक गंभीर समस्या बनता जा रहा है, और उत्तरी अमेरिका में, यह नेमाटोड बाहरी पाइन प्रजातियों को नष्ट कर देता है।¹² पाइन वृक्षों का क्षय एक प्रमुख आर्थिक समस्या है, और इसके वैश्विक प्रसार की संभावना चिंताजनक है।³ निम्नलिखित पाइन प्रजातियाँ इस नेमाटोड से सबसे अधिक प्रभावित होती हैं: पिनस डेंसिफ्लोरा, पिनस सिल्वेस्ट्रिस, पिनस थुनबर्गि, पिनस कोरिएन्सिस, पिनस थुनबर्गि और पिनस रेडियाटा।⁴ पाइन नेमाटोड एक गंभीर रोग है जो संक्रमण के कुछ हफ्तों या महीनों के भीतर पाइन वृक्षों को नष्ट कर सकता है। इसके अलावा, चीड़ के नेमाटोड का प्रकोप विभिन्न पारिस्थितिक तंत्रों में आम है, इसलिए लगातार संक्रमण श्रृंखलाएं स्थापित हो गई हैं1।
बर्सफेलेनचस ज़ाइलोफिलस एक संगरोधक पादप-परजीवी नेमाटोड है जो एपेलेंकोइडिया सुपरफैमिली और क्लेड 102.5 से संबंधित है। यह नेमाटोड कवक पर भोजन करता है और चीड़ के पेड़ों के लकड़ी के ऊतकों में प्रजनन करता है, और चार अलग-अलग लार्वा अवस्थाओं में विकसित होता है: L1, L2, L3, L4 और एक वयस्क जीव1,6। भोजन की कमी की स्थिति में, चीड़ का नेमाटोड एक विशेष लार्वा अवस्था - डाउर - में परिवर्तित हो जाता है, जो अपने वाहक - चीड़ की छाल के भृंग (मोनोचामस अल्टरनाटस) पर परजीवी के रूप में रहता है और स्वस्थ चीड़ के पेड़ों में स्थानांतरित हो जाता है। स्वस्थ पौधों में, नेमाटोड तेजी से पादप ऊतकों में फैलते हैं और पैरेन्काइमेटस कोशिकाओं पर भोजन करते हैं, जिससे कई अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएं, चीड़ का मुरझाना और संक्रमण के एक वर्ष के भीतर मृत्यु हो जाती है1,7,8।
चीड़ के नेमाटोडों का जैविक नियंत्रण लंबे समय से एक चुनौती रहा है, जिसके लिए 20वीं शताब्दी से ही संगरोध उपाय लागू हैं। चीड़ के नेमाटोडों को नियंत्रित करने की वर्तमान रणनीतियों में मुख्य रूप से रासायनिक उपचार शामिल हैं, जिनमें लकड़ी का धूमन और वृक्षों के तनों में नेमाटाइड का प्रत्यारोपण शामिल है। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले नेमाटाइड एवरमेक्टिन और एवरमेक्टिन बेंजोएट हैं, जो एवरमेक्टिन परिवार से संबंधित हैं। ये महंगे रसायन कई नेमाटोड प्रजातियों के खिलाफ अत्यधिक प्रभावी हैं और इन्हें पर्यावरण के लिए सुरक्षित माना जाता है9। हालांकि, इन नेमाटाइडों के बार-बार उपयोग से चयन दबाव उत्पन्न होने की आशंका है, जिससे लगभग निश्चित रूप से प्रतिरोधी चीड़ के नेमाटोडों का उदय होगा, जैसा कि कई कीटों, जैसे कि लेप्टिनोटार्सा डेसेमलाइनटा, ​​प्लूटेला जाइलोस्टेला और नेमाटोड ट्राइकोस्ट्रॉन्गिलस कोलुब्रिफॉर्मिस और ऑस्टर्टागिया सर्कमसिंक्टा के मामले में देखा गया है, जिन्होंने धीरे-धीरे एवरमेक्टिन के प्रति प्रतिरोध विकसित कर लिया है10,11,12। इसलिए, पीवीडी को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक, लागत प्रभावी और पर्यावरण के अनुकूल उपायों को खोजने के लिए प्रतिरोध पैटर्न का नियमित रूप से अध्ययन और नेमाटाइड की निरंतर जांच की आवश्यकता है। हाल के दशकों में, कई लेखकों ने नेमाटोड नियंत्रण एजेंटों के रूप में पौधों के अर्क, आवश्यक तेलों और वाष्पशील पदार्थों के उपयोग का प्रस्ताव दिया है13,14,15,16।
हमने हाल ही में कैनेरोहैब्डिटिस एलिगेंस 17 में इंडोल, एक अंतरकोशिकीय और अंतरराज्यीय संकेत अणु, की नेमाटिसाइडल गतिविधि का प्रदर्शन किया। इंडोल सूक्ष्मजीव पारिस्थितिकी में एक व्यापक अंतःकोशिकीय संकेत है, जो सूक्ष्मजीव शरीर क्रिया विज्ञान, बीजाणु निर्माण, प्लास्मिड स्थिरता, दवा प्रतिरोध, बायोफिल्म निर्माण और विषाणुता 18, 19 को प्रभावित करने वाले कई कार्यों को नियंत्रित करता है। अन्य रोगजनक नेमाटोड के विरुद्ध इंडोल और इसके व्युत्पन्नों की गतिविधि का अध्ययन नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, हमने चीड़ के नेमाटोड के विरुद्ध 34 इंडोल की नेमाटिसाइडल गतिविधि की जांच की और सूक्ष्मदर्शी, टाइम-लैप्स फोटोग्राफी और आणविक डॉकिंग प्रयोगों का उपयोग करके सबसे शक्तिशाली 5-आयोडोइंडोल की क्रियाविधि को स्पष्ट किया, और बीज अंकुरण परीक्षण का उपयोग करके पौधों पर इसके विषाक्त प्रभावों का आकलन किया।
इंडोल की उच्च सांद्रता (>1.0 mM) को पहले नेमाटोड पर नेमाटोडनाशक प्रभाव डालने के लिए जाना जाता था।17 इंडोल या 33 विभिन्न इंडोल व्युत्पन्नों के साथ 1 mM सांद्रता पर B. xylophilus (मिश्रित जीवन अवस्थाओं) के उपचार के बाद, नियंत्रण और उपचारित समूहों में जीवित और मृत नेमाटोडों की गणना करके B. xylophilus की मृत्यु दर को मापा गया। पाँच इंडोल ने महत्वपूर्ण नेमाटोडनाशक गतिविधि प्रदर्शित की; अनुपचारित नियंत्रण समूह की उत्तरजीविता 24 घंटे बाद 95 ± 7% थी। परीक्षण किए गए 34 इंडोल में से, 5-आयोडोइंडोल और 4-फ्लोरोइंडोल ने 1 mM सांद्रता पर 100% मृत्यु दर उत्पन्न की, जबकि 5,6-डिफ्लोरोइंडिगो, मिथाइलइंडोल-7-कार्बोक्सिलेट और 7-आयोडोइंडोल ने लगभग 50% मृत्यु दर उत्पन्न की (तालिका 1)।
पाइन वुड नेमाटोड के रिक्तिका निर्माण और चयापचय पर 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव। (A) वयस्क नर नेमाटोड पर एवरमेक्टिन और 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव, (B) L1 अवस्था के नेमाटोड अंडे और (C) बी. ज़ाइलोफिलस का चयापचय। (i) 0 घंटे पर रिक्तिकाएँ नहीं देखी गईं, उपचार के परिणामस्वरूप (ii) रिक्तिकाएँ, (iii) कई रिक्तिकाओं का संचय, (iv) रिक्तिकाओं का फूलना, (v) रिक्तिकाओं का संलयन और (vi) विशाल रिक्तिकाओं का निर्माण हुआ। लाल तीर रिक्तिकाओं के फूलने को, नीले तीर रिक्तिकाओं के संलयन को और काले तीर विशाल रिक्तिकाओं को दर्शाते हैं। स्केल बार = 50 μm।
इसके अतिरिक्त, इस अध्ययन में पाइन नेमाटोड में मीथेन-प्रेरित मृत्यु की अनुक्रमिक प्रक्रिया का भी वर्णन किया गया है (चित्र 4C)। मीथेनोजेनिक मृत्यु एक गैर-एपॉप्टोटिक प्रकार की कोशिका मृत्यु है जो प्रमुख साइटोप्लाज्मिक रिक्तिकाओं के संचय से जुड़ी होती है27। पाइन नेमाटोड में देखे गए रूपात्मक दोष मीथेन-प्रेरित मृत्यु की क्रियाविधि से निकटता से संबंधित प्रतीत होते हैं। विभिन्न समयों पर सूक्ष्मदर्शी परीक्षण से पता चला कि 5-आयोडोइंडोल (0.1 mM) के संपर्क में आने के 20 घंटे बाद विशाल रिक्तिकाएँ बन गईं। उपचार के 8 घंटे बाद सूक्ष्मदर्शी रिक्तिकाएँ देखी गईं, और 12 घंटे बाद उनकी संख्या बढ़ गई। 14 घंटे बाद कई बड़ी रिक्तिकाएँ देखी गईं। उपचार के 12-16 घंटे बाद कई संलयनित रिक्तिकाएँ स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थीं, जो यह दर्शाती हैं कि रिक्तिका संलयन मीथेनोजेनिक मृत्यु क्रियाविधि का आधार है। 20 घंटे बाद, पूरे कृमि में कई विशाल रिक्तिकाएँ पाई गईं। ये अवलोकन सी. एलिगेंस में मेटुओसिस की पहली रिपोर्ट प्रस्तुत करते हैं।
5-आयोडोइंडोल से उपचारित कृमियों में, रिक्तिका का एकत्रीकरण और टूटना भी देखा गया (चित्र 5), जैसा कि कृमि के मुड़ने और रिक्तिका के वातावरण में निकलने से स्पष्ट होता है। अंडे के खोल की झिल्ली में भी रिक्तिका का विघटन देखा गया, जो सामान्यतः अंडे से निकलने के दौरान L2 द्वारा अक्षुण्ण संरक्षित रहती है (पूरक चित्र S2)। ये अवलोकन रिक्तिका निर्माण और मवाद बनने की प्रक्रिया में द्रव संचय और परासरण विफलता, साथ ही प्रतिवर्ती कोशिका क्षति (RCI) की भूमिका का समर्थन करते हैं (चित्र 5)।
देखी गई रिक्तिका निर्माण में आयोडीन की भूमिका की परिकल्पना करते हुए, हमने सोडियम आयोडाइड (NaI) और पोटेशियम आयोडाइड (KI) की नेमाटिसाइडल गतिविधि की जांच की। हालांकि, 0.1, 0.5 या 1 mM सांद्रता पर, उन्होंने न तो नेमाटोड के जीवित रहने और न ही रिक्तिका निर्माण को प्रभावित किया (पूरक चित्र S5), हालांकि 1 mM KI का थोड़ा नेमाटिसाइडल प्रभाव था। दूसरी ओर, 7-आयोडोइंडोल (1 या 2 mM), 5-आयोडोइंडोल की तरह, कई रिक्तिकाओं और संरचनात्मक विकृतियों को प्रेरित करता है (पूरक चित्र S6)। दोनों आयोडोइंडोल ने पाइन नेमाटोड में समान फेनोटाइपिक लक्षण दिखाए, जबकि NaI और KI ने नहीं दिखाए। दिलचस्प बात यह है कि इंडोल ने परीक्षण की गई सांद्रता पर B. xylophilus में रिक्तिका निर्माण को प्रेरित नहीं किया (डेटा नहीं दिखाया गया)। इस प्रकार, परिणामों ने पुष्टि की कि इंडोल-आयोडीन कॉम्प्लेक्स बी. जाइलोफिलस के वैक्यूओलाइजेशन और चयापचय के लिए जिम्मेदार है।
नेमाटिसाइडल गतिविधि के लिए परीक्षण किए गए इंडोल्स में, 5-आयोडोइंडोल का स्लिप इंडेक्स सबसे अधिक -5.89 किलोकैलोरी/मोल था, इसके बाद 7-आयोडोइंडोल (-4.48 किलोकैलोरी/मोल), 4-फ्लोरोइंडोल (-4.33) और इंडोल (-4.03) का स्थान था (चित्र 6)। 5-आयोडोइंडोल का ल्यूसीन 218 के साथ मजबूत बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्डिंग इसके बंधन को स्थिर करता है, जबकि अन्य सभी इंडोल डेरिवेटिव साइड चेन हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से सेरीन 260 से बंधते हैं। अन्य प्रतिरूपित आयोडोइंडोलों में, 2-आयोडोइंडोल का बंधन मान -5.248 किलोकैलोरी/मोल है, जो ल्यूसीन 218 के साथ इसके मुख्य हाइड्रोजन बंधन के कारण है। अन्य ज्ञात बंधनों में 3-आयोडोइंडोल (-4.3 किलोकैलोरी/मोल), 4-आयोडोइंडोल (-4.0 किलोकैलोरी/मोल), और 6-फ्लोरोइंडोल (-2.6 किलोकैलोरी/मोल) शामिल हैं (पूरक चित्र S8)। अधिकांश हैलोजनीकृत इंडोल और स्वयं इंडोल, 5-आयोडोइंडोल और 2-आयोडोइंडोल को छोड़कर, सेरीन 260 के साथ एक बंध बनाते हैं। यह तथ्य कि ल्यूसीन 218 के साथ हाइड्रोजन बंधन कुशल रिसेप्टर-लिगैंड बंधन का संकेत देता है, जैसा कि आइवरमेक्टिन के लिए देखा गया है (पूरक चित्र S7), पुष्टि करता है कि 5-आयोडोइंडोल और 2-आयोडोइंडोल, आइवरमेक्टिन की तरह, ल्यूसीन 218 के माध्यम से GluCL रिसेप्टर के सक्रिय स्थल से मजबूती से बंधते हैं (चित्र 6 और पूरक चित्र S8)। हमारा प्रस्ताव है कि यह बंधन GluCL कॉम्प्लेक्स की खुली छिद्र संरचना को बनाए रखने के लिए आवश्यक है और GluCL रिसेप्टर के सक्रिय स्थल से मजबूती से बंधकर, 5-आयोडोइंडोल, 2-आयोडोइंडोल, एवरमेक्टिन और आइवरमेक्टिन इस प्रकार आयन चैनल को खुला रखते हैं और द्रव अवशोषण की अनुमति देते हैं।
ग्लूसीएल से इंडोल और हैलोजनीकृत इंडोल का आणविक डॉकिंग। ग्लूसीएल के सक्रिय स्थल पर (A) इंडोल, (B) 4-फ्लोरोइंडोल, (C) 7-आयोडोइंडोल और (D) 5-आयोडोइंडोल लिगेंड के बंधन अभिविन्यास। प्रोटीन को एक रिबन द्वारा दर्शाया गया है, और बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड को पीली बिंदीदार रेखाओं से दिखाया गया है। (A′), (B′), (C′) और (D′) संबंधित लिगेंड की आसपास के अमीनो एसिड अवशेषों के साथ अंतःक्रियाओं को दर्शाते हैं, और साइड-चेन हाइड्रोजन बॉन्ड को गुलाबी बिंदीदार तीरों द्वारा इंगित किया गया है।
पत्तागोभी और मूली के बीजों के अंकुरण पर 5-आयोडोइंडोल के विषाक्त प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किए गए। 5-आयोडोइंडोल (0.05 या 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/mL) का प्रारंभिक अंकुरण और अंकुरण पर नगण्य या नगण्य प्रभाव पड़ा (चित्र 7)। इसके अलावा, अनुपचारित नियंत्रण और 5-आयोडोइंडोल या एवरमेक्टिन से उपचारित बीजों की अंकुरण दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। मुख्य जड़ के विस्तार और बनने वाली पार्श्व जड़ों की संख्या पर प्रभाव नगण्य था, हालांकि 1 mM (इसकी सक्रिय सांद्रता का 10 गुना) 5-आयोडोइंडोल ने पार्श्व जड़ों के विकास में थोड़ी देरी की। ये परिणाम दर्शाते हैं कि 5-आयोडोइंडोल पादप कोशिकाओं के लिए विषैला नहीं है और अध्ययन की गई सांद्रता पर पादप विकास प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करता है।
बीज अंकुरण पर 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव। एवरमेक्टिन या 5-आयोडोइंडोल की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मुराशीगे और स्कूग अगर माध्यम पर बी. ओलेरेसिया और आर. रैफेनिस्ट्रम के बीजों का अंकुरण, अंकुरण और पार्श्व जड़ विकास। 22°C पर 3 दिनों के ऊष्मायन के बाद अंकुरण दर्ज किया गया।
इस अध्ययन में इंडोल द्वारा नेमाटोड को मारने के कई मामलों की रिपोर्ट दी गई है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह चीड़ की पत्तियों में आयोडोइंडोल द्वारा प्रेरित मिथाइलेशन (एक ऐसी प्रक्रिया जो छोटी रिक्तिकाओं के संचय के कारण होती है जो धीरे-धीरे विशाल रिक्तिकाओं में विलीन हो जाती हैं, अंततः झिल्ली के फटने और मृत्यु का कारण बनती हैं) की पहली रिपोर्ट है, जिसमें आयोडोइंडोल व्यावसायिक नेमाटोडनाशक एवरमेक्टिन के समान महत्वपूर्ण नेमाटोडनाशक गुण प्रदर्शित करता है।
पहले भी प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स में इंडोल्स द्वारा कई सिग्नलिंग कार्यों को प्रदर्शित करने की रिपोर्ट की गई है, जिनमें बायोफिल्म अवरोध/गठन, जीवाणु उत्तरजीविता और रोगजनकता शामिल हैं19,32,33,34। हाल ही में, हैलोजेनेटेड इंडोल्स, इंडोल एल्कलॉइड्स और अर्ध-सिंथेटिक इंडोल डेरिवेटिव्स के संभावित चिकित्सीय प्रभावों ने व्यापक अनुसंधान रुचि को आकर्षित किया है35,36,37। उदाहरण के लिए, हैलोजेनेटेड इंडोल्स को लगातार एस्चेरिचिया कोलाई और स्टैफिलोकोकस ऑरियस कोशिकाओं को मारने में सक्षम दिखाया गया है37। इसके अलावा, अन्य प्रजातियों, वंशों और जगतों के विरुद्ध हैलोजेनेटेड इंडोल्स की प्रभावकारिता का अध्ययन करना वैज्ञानिक दृष्टि से महत्वपूर्ण है, और यह अध्ययन इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में एक कदम है।
यहां, हम प्रतिवर्ती कोशिका क्षति (RCI) और मिथाइलेशन (चित्र 4C और 5) के आधार पर C. elegans में 5-आयोडोइंडोल-प्रेरित घातकता के लिए एक तंत्र प्रस्तावित करते हैं। सूजन और रिक्तिका अपघटन जैसे एडिमाटस परिवर्तन RCI और मिथाइलेशन के संकेतक हैं, जो साइटोप्लाज्म में विशाल रिक्तिकाओं के रूप में प्रकट होते हैं48,49। RCI एटीपी उत्पादन को कम करके, एटीपीएज़ पंप की विफलता का कारण बनकर, या कोशिका झिल्ली को बाधित करके और Na+, Ca2+, और पानी के तीव्र प्रवाह का कारण बनकर ऊर्जा उत्पादन में बाधा डालता है50,51,52। Ca2+ और पानी के प्रवाह के कारण साइटोप्लाज्म में द्रव संचय के परिणामस्वरूप पशु कोशिकाओं में अंतःसाइटोप्लाज्मिक रिक्तिकाएं उत्पन्न होती हैं53। दिलचस्प बात यह है कि कोशिका क्षति का यह तंत्र प्रतिवर्ती होता है यदि क्षति अस्थायी हो और कोशिकाएं एक निश्चित अवधि के लिए एटीपी का उत्पादन शुरू कर दें, लेकिन यदि क्षति बनी रहती है या बिगड़ जाती है, तो कोशिकाएं मर जाती हैं।54 हमारे अवलोकन दर्शाते हैं कि 5-आयोडोइंडोल से उपचारित नेमाटोड तनाव की स्थितियों के संपर्क में आने के बाद सामान्य जैवसंश्लेषण को बहाल करने में असमर्थ हैं।
बी. ज़ाइलोफिलस में 5-आयोडोइंडोल द्वारा प्रेरित मिथाइलेशन फेनोटाइप आयोडीन की उपस्थिति और उसके आणविक वितरण के कारण हो सकता है, क्योंकि 7-आयोडोइंडोल का बी. ज़ाइलोफिलस पर 5-आयोडोइंडोल की तुलना में कम निरोधात्मक प्रभाव था (तालिका 1 और पूरक चित्र S6)। ये परिणाम माल्टीज़ एट अल. (2014) के अध्ययनों के साथ आंशिक रूप से सुसंगत हैं, जिन्होंने बताया कि इंडोल में पाइरिडिल नाइट्रोजन अंश का पैरा-स्थिति से मेटा-स्थिति में स्थानांतरण यू251 कोशिकाओं में वैक्यूओलाइज़ेशन, वृद्धि अवरोध और साइटोटॉक्सिसिटी को समाप्त कर देता है, यह सुझाव देते हुए कि प्रोटीन में एक विशिष्ट सक्रिय स्थल के साथ अणु की अंतःक्रिया महत्वपूर्ण है27,44,45। इस अध्ययन में इंडोल या हैलोजेनयुक्त इंडोल और GluCL रिसेप्टर्स के बीच देखी गई परस्पर क्रियाएँ भी इस धारणा का समर्थन करती हैं, क्योंकि 5- और 2-आयोडोइंडोल अन्य जांचे गए इंडोल की तुलना में GluCL रिसेप्टर्स से अधिक मजबूती से बंधते पाए गए (चित्र 6 और पूरक चित्र S8)। इंडोल के दूसरे या पाँचवें स्थान पर स्थित आयोडीन, बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से GluCL रिसेप्टर के ल्यूसीन 218 से बंधता पाया गया, जबकि अन्य हैलोजेनयुक्त इंडोल और स्वयं इंडोल, सेरीन 260 के साथ कमजोर साइड-चेन हाइड्रोजन बॉन्ड बनाते हैं (चित्र 6)। इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि हैलोजन का स्थान वैक्यूलर डीजेनरेशन को प्रेरित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जबकि 5-आयोडोइंडोल का मजबूत बंधन आयन चैनल को खुला रखता है, जिससे तेजी से द्रव प्रवाह और वैक्यूल का टूटना संभव होता है। हालांकि, 5-आयोडोइंडोल की क्रियाविधि का विस्तृत निर्धारण अभी बाकी है।
5-आयोडोइंडोल के व्यावहारिक अनुप्रयोग से पहले, पौधों पर इसके विषाक्त प्रभाव का विश्लेषण किया जाना चाहिए। हमारे बीज अंकुरण प्रयोगों से पता चला कि अध्ययन की गई सांद्रता पर 5-आयोडोइंडोल का बीज अंकुरण या बाद की विकास प्रक्रियाओं पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 7)। इस प्रकार, यह अध्ययन चीड़ के पेड़ों के लिए चीड़ के नेमाटोड के हानिकारक प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए पारिस्थितिक वातावरण में 5-आयोडोइंडोल के उपयोग का आधार प्रदान करता है।
पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि इंडोल-आधारित चिकित्सा एंटीबायोटिक प्रतिरोध और कैंसर की प्रगति की समस्या से निपटने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है।55 इसके अलावा, इंडोल में जीवाणुरोधी, कैंसररोधी, एंटीऑक्सीडेंट, सूजनरोधी, मधुमेहरोधी, विषाणुरोधी, प्रसाररोधी और तपेदिकरोधी गतिविधियाँ होती हैं और यह दवा विकास के लिए एक आशाजनक आधार के रूप में कार्य कर सकता है।56,57 यह अध्ययन पहली बार आयोडीन के परजीवीरोधी और कृमिनाशक एजेंट के रूप में संभावित उपयोग का सुझाव देता है।
एवरमेक्टिन की खोज तीन दशक पहले हुई थी और इसे 2015 में नोबेल पुरस्कार मिला था। कृमिनाशक के रूप में इसका उपयोग अभी भी जारी है। हालांकि, नेमाटोड और कीटों में एवरमेक्टिन के प्रति प्रतिरोधक क्षमता के तेजी से विकास के कारण, चीड़ के पेड़ों में पाइन नेमाटोड संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए एक वैकल्पिक, कम लागत वाली और पर्यावरण के अनुकूल रणनीति की आवश्यकता है। यह अध्ययन उस क्रियाविधि की भी जानकारी देता है जिसके द्वारा 5-आयोडोइंडोल चीड़ के नेमाटोड को मारता है और यह भी कि 5-आयोडोइंडोल पौधों की कोशिकाओं के लिए कम विषैला होता है, जिससे इसके भविष्य में व्यावसायिक उपयोग की अच्छी संभावनाएं खुलती हैं।
सभी प्रयोगों को येउंगनाम विश्वविद्यालय, ग्योंगसान, कोरिया की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और विधियों को येउंगनाम विश्वविद्यालय की नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार निष्पादित किया गया था।
स्थापित प्रक्रियाओं43 का उपयोग करके अंडाणु ऊष्मायन प्रयोग किए गए। हैचिंग दर (एचआर) का आकलन करने के लिए, 1 दिन के वयस्क नेमाटोड (लगभग 100 मादा और 100 नर) को कवक युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित किया गया और 24 घंटे तक बढ़ने दिया गया। इसके बाद अंडों को अलग किया गया और उन्हें 5-आयोडोइंडोल (0.05 mM और 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/ml) के साथ बाँझ आसुत जल में घोल के रूप में उपचारित किया गया। इन घोलों (500 μl; लगभग 100 अंडे) को 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट के कुओं में स्थानांतरित किया गया और 22 °C पर ऊष्मायन किया गया। 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद L2 की गणना की गई, लेकिन यदि कोशिकाओं को एक महीन प्लैटिनम तार से उत्तेजित करने पर वे गति नहीं करती थीं, तो उन्हें मृत माना गया। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया, प्रत्येक चरण में छह बार दोहराव हुआ। दोनों प्रयोगों के डेटा को संयोजित करके प्रस्तुत किया गया। मानव संसाधन प्रतिशत की गणना निम्न प्रकार से की जाती है:
पूर्व में विकसित प्रक्रियाओं का उपयोग करके लार्वा मृत्यु दर का आकलन किया गया। नेमाटोड के अंडे एकत्र किए गए और भ्रूणों को रोगाणु रहित आसुत जल में सेने के द्वारा सिंक्रनाइज़ किया गया ताकि L2 चरण के लार्वा उत्पन्न हो सकें। सिंक्रनाइज़ किए गए लार्वा (लगभग 500 नेमाटोड) को 5-आयोडोइंडोल (0.05 mM और 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/ml) से उपचारित किया गया और बी. सिनेरिया पेट्री प्लेटों पर पाला गया। 22°C पर 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद, नेमाटोड को रोगाणु रहित आसुत जल में एकत्र किया गया और उनमें L2, L3 और L4 चरणों की उपस्थिति की जाँच की गई। L3 और L4 चरणों की उपस्थिति लार्वा रूपांतरण को दर्शाती है, जबकि L2 चरण की उपस्थिति रूपांतरण न होने का संकेत देती है। iRiS™ डिजिटल सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियाँ प्राप्त की गईं। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया, प्रत्येक चरण में छह पुनरावृत्तियाँ थीं। दोनों प्रयोगों के डेटा को संयोजित करके प्रस्तुत किया गया।
मुरशीगे और स्कूग एगर प्लेटों पर अंकुरण परीक्षणों का उपयोग करके बीजों पर 5-आयोडोइंडोल और एवरमेक्टिन की विषाक्तता का आकलन किया गया।62 बी. ओलेरेसिया और आर. रैफेनिस्ट्रम के बीजों को पहले एक दिन के लिए रोगाणु रहित आसुत जल में भिगोया गया, फिर 1 मिलीलीटर 100% इथेनॉल से धोया गया, 15 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर 50% व्यावसायिक ब्लीच (3% सोडियम हाइपोक्लोराइट) से रोगाणुरहित किया गया और 1 मिलीलीटर रोगाणु रहित जल से पाँच बार धोया गया। रोगाणुरहित बीजों को फिर 0.86 ग्राम/लीटर (0.2X) मुरशीगे और स्कूग माध्यम और 0.7% जीवाणुनाशक एगर युक्त अंकुरण एगर प्लेटों पर दबाया गया, जिसमें 5-आयोडोइंडोल या एवरमेक्टिन हो भी सकता है और नहीं भी। प्लेटों को फिर 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया और 3 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद चित्र लिए गए। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया, जिनमें से प्रत्येक में छह पुनरावृत्तियाँ थीं।