पाइन के नेमाटोड रोग के प्रेरक के रूप में आयोडीन और एवरमेक्टिन का मूल्यांकन

पाइन नेमाटोड एक संगरोध प्रवासी अंतःपरजीवी है जो पाइन वन पारिस्थितिकी तंत्र में गंभीर आर्थिक नुकसान का कारण बनता है। वर्तमान अध्ययन पाइन नेमाटोड के खिलाफ हैलोजेनेटेड इंडोल की नेमाटोसाइडल गतिविधि और उनकी क्रियाविधि की समीक्षा करता है। पाइन नेमाटोड के खिलाफ 5-आयोडोइंडोल और एवरमेक्टिन (पॉजिटिव कंट्रोल) की नेमाटोसाइडल गतिविधियाँ समान थीं और कम सांद्रता (10 μg/mL) पर उच्च थीं। 5-आयोडोइंडोल ने प्रजनन क्षमता, प्रजनन गतिविधि, भ्रूण और लार्वा मृत्यु दर और हरकत व्यवहार को कम कर दिया। अकशेरुकी-विशिष्ट ग्लूटामेट-गेटेड क्लोराइड चैनल रिसेप्टर्स के साथ लिगैंड्स की आणविक अंतःक्रियाएं इस धारणा का समर्थन करती हैं कि 5-आयोडोइंडोल, एवरमेक्टिन की तरह, रिसेप्टर सक्रिय साइट से कसकर बंधता है। 5-आयोडोइंडोल ने नेमाटोड में असामान्य अंग पतन/सिकुड़न और बढ़ी हुई रिक्तिका सहित विभिन्न फेनोटाइपिक विकृतियाँ भी प्रेरित कीं। इन परिणामों से पता चलता है कि रिक्तिकाएँ नेमाटोड मिथाइलेशन-मध्यस्थ मृत्यु में भूमिका निभा सकती हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि 5-आयोडोइंडोल दोनों पौधों की प्रजातियों (गोभी और मूली) के लिए गैर-विषाक्त था। इस प्रकार, यह अध्ययन दर्शाता है कि पर्यावरणीय परिस्थितियों में आयोडोइंडोल का उपयोग पाइन विल्ट चोट को नियंत्रित कर सकता है।
पाइन वुड नेमाटोड (बर्साफेलेंचस ज़ाइलोफिलस) पाइन वुड नेमाटोड्स (PWN) से संबंधित है, प्रवासी एंडोपैरासिटिक नेमाटोड्स जो पाइन वन पारिस्थितिकी प्रणालियों को गंभीर पारिस्थितिक क्षति पहुँचाने के लिए जाने जाते हैं1. पाइन वुड नेमाटोड के कारण होने वाली पाइन विल्ट बीमारी (PWD) एशिया और यूरोप सहित कई महाद्वीपों पर एक गंभीर समस्या बन रही है, और उत्तरी अमेरिका में नेमाटोड पाइन प्रजातियों को नष्ट कर देता है1,2. पाइन के पेड़ों की संख्या में गिरावट एक बड़ी आर्थिक समस्या है, और इसके वैश्विक प्रसार की संभावना चिंताजनक है3. निम्नलिखित पाइन प्रजातियाँ नेमाटोड द्वारा सबसे अधिक हमला की जाती हैं: पिनस डेंसिफ्लोरा, पिनस सिल्वेस्ट्रिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस कोराइनेसिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस थुनबर्गी और पिनस रेडिएटा4. पाइन नेमाटोड एक गंभीर बीमारी है जो संक्रमण के कुछ हफ़्तों या महीनों के भीतर पाइन के पेड़ों को मार सकती है. इसके अतिरिक्त, पाइन नेमाटोड का प्रकोप विभिन्न पारिस्थितिकी प्रणालियों में आम है, इसलिए लगातार संक्रमण श्रृंखलाएं स्थापित हो गई हैं1।
बर्सफेलेंचस ज़ाइलोफिलस एक संगरोध पौधा-परजीवी निमेटोड है जो सुपरफ़ैमिली एफ़ेलेनचोइडिया और क्लेड 102.5 से संबंधित है। निमेटोड कवक पर फ़ीड करता है और चीड़ के पेड़ों के लकड़ी के ऊतकों में प्रजनन करता है, चार अलग-अलग लार्वा चरणों में विकसित होता है: L1, L2, L3, L4 और एक वयस्क व्यक्ति1,6। भोजन की कमी की स्थिति में, चीड़ का निमेटोड एक विशेष लार्वा चरण - डौअर में चला जाता है, जो अपने वेक्टर - चीड़ की छाल बीटल (मोनोकैमस अल्टरनैटस) पर परजीवी होता है और स्वस्थ चीड़ के पेड़ों में स्थानांतरित हो जाता है। स्वस्थ मेजबानों में, निमेटोड पौधे के ऊतकों के माध्यम से तेज़ी से पलायन करते हैं और पैरेन्काइमेटस कोशिकाओं पर फ़ीड करते हैं, जिससे संक्रमण के एक साल के भीतर कई अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाएँ, चीड़ का मुरझाना और मृत्यु हो जाती है1,7,8।
चीड़ के निमेटोड का जैविक नियंत्रण लंबे समय से एक चुनौती रहा है, संगरोध उपायों का इतिहास 20वीं सदी से ही है। चीड़ के निमेटोड को नियंत्रित करने की वर्तमान रणनीतियों में मुख्य रूप से रासायनिक उपचार शामिल हैं, जिसमें लकड़ी का धूमन और पेड़ के तने में निमेटाइड्स का प्रत्यारोपण शामिल है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले निमेटाइड्स एवरमेक्टिन और एवरमेक्टिन बेंजोएट हैं, जो एवरमेक्टिन परिवार से संबंधित हैं। ये महंगे रसायन कई निमेटोड प्रजातियों के खिलाफ अत्यधिक प्रभावी हैं और पर्यावरण के लिए सुरक्षित माने जाते हैं9। हालांकि, इन निमेटाइड्स के बार-बार उपयोग से चयन दबाव पैदा होने की उम्मीद है जो लगभग निश्चित रूप से प्रतिरोधी पाइन निमेटोड के उद्भव का कारण बनेगा, जैसा कि कई कीटों के लिए प्रदर्शित किया गया है, जैसे कि लेप्टिनोटार्सा डिसमलिनेटा, प्लूटेला ज़ाइलोस्टेला और निमेटोड ट्राइकोस्ट्रॉन्गिलस कोलुब्रिफॉर्मिस और ओस्टरटेगिया सर्कमसिंटा, जिन्होंने धीरे-धीरे एवरमेक्टिन10,11,12 के लिए प्रतिरोध विकसित किया है। इसलिए, पीवीडी को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक, लागत प्रभावी और पर्यावरण के अनुकूल उपाय खोजने के लिए प्रतिरोध पैटर्न का नियमित रूप से अध्ययन किया जाना चाहिए और नेमाटोसाइड्स की लगातार जांच की जानी चाहिए। हाल के दशकों में, कई लेखकों ने नेमाटोड नियंत्रण एजेंटों के रूप में पौधों के अर्क, आवश्यक तेलों और वाष्पशील पदार्थों के उपयोग का प्रस्ताव दिया है13,14,15,16।
हमने हाल ही में कैनोरहेबडाइटिस एलिगेंस 17 में इंडोल, एक अंतरकोशिकीय और अंतरराज्यीय सिग्नलिंग अणु की नेमाटोसाइडल गतिविधि का प्रदर्शन किया। इंडोल माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में एक व्यापक इंट्रासेल्युलर सिग्नल है, जो माइक्रोबियल फिजियोलॉजी, बीजाणु गठन, प्लास्मिड स्थिरता, दवा प्रतिरोध, बायोफिल्म गठन, और विषाणु 18, 19 को प्रभावित करने वाले कई कार्यों को नियंत्रित करता है। अन्य रोगजनक नेमाटोड के खिलाफ इंडोल और इसके व्युत्पन्न की गतिविधि का अध्ययन नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, हमने पाइन नेमाटोड के खिलाफ 34 इंडोल्स की नेमाटोसाइडल गतिविधि की जांच की और माइक्रोस्कोपी, टाइम-लैप्स फोटोग्राफी और आणविक डॉकिंग प्रयोगों का उपयोग करके सबसे शक्तिशाली 5-आयोडोइंडोल की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट किया
इंडोल की उच्च सांद्रता (>1.0 mM) को पहले से ही नेमाटोड17 पर नेमाटोसाइडल प्रभाव डालने वाला बताया गया है। इंडोल या 33 विभिन्न इंडोल व्युत्पन्नों के साथ 1 mM पर B. ज़ाइलोफिलस (मिश्रित जीवन चरणों) के उपचार के बाद, नियंत्रण और उपचारित समूहों में जीवित और मृत नेमाटोड की गिनती करके B. ज़ाइलोफिलस की मृत्यु दर को मापा गया। पाँच इंडोल ने महत्वपूर्ण नेमाटोसाइडल गतिविधि प्रदर्शित की; अनुपचारित नियंत्रण समूह का अस्तित्व 24 घंटे के बाद 95 ± 7% था। परीक्षण किए गए 34 इंडोल में से, 1 mM पर 5-आयोडोइंडोल और 4-फ्लूरोइंडोल ने 100% मृत्यु दर का कारण बना, जबकि 5,6-डाइफ्लूरोइंडिगो, मिथाइलइंडोल-7-कार्बोक्सिलेट और 7-आयोडोइंडोल ने लगभग 50% मृत्यु दर का कारण बना (तालिका 1)।
पाइन वुड नेमाटोड के रिक्तिका निर्माण और चयापचय पर 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव। (ए) वयस्क नर नेमाटोड पर एवरमेक्टिन और 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव, (बी) एल1 चरण नेमाटोड अंडे और (सी) बी. ज़ाइलोफिलस का चयापचय, (i) 0 घंटे पर रिक्तिकाएँ नहीं देखी गईं, उपचार के परिणामस्वरूप (ii) रिक्तिकाएँ, (iii) कई रिक्तिकाओं का संचय, (iv) रिक्तिकाओं की सूजन, (v) रिक्तिकाओं का संलयन और (vi) विशाल रिक्तिकाओं का निर्माण हुआ। लाल तीर रिक्तिकाओं की सूजन को इंगित करते हैं, नीले तीर रिक्तिकाओं के संलयन को इंगित करते हैं और काले तीर विशाल रिक्तिकाओं को इंगित करते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन।
इसके अलावा, इस अध्ययन में पाइन नेमाटोड में मीथेन-प्रेरित मृत्यु की अनुक्रमिक प्रक्रिया का भी वर्णन किया गया है (चित्र 4C)। मीथेनोजेनिक मृत्यु एक गैर-एपोप्टोटिक प्रकार की कोशिका मृत्यु है जो प्रमुख साइटोप्लाज्मिक रिक्तिकाओं के संचय से जुड़ी है27। पाइन नेमाटोड में देखे गए रूपात्मक दोष मीथेन-प्रेरित मृत्यु के तंत्र से निकटता से संबंधित प्रतीत होते हैं। अलग-अलग समय पर सूक्ष्म परीक्षण से पता चला कि 5-आयोडोइंडोल (0.1 mM) के संपर्क में आने के 20 घंटे बाद विशाल रिक्तिकाएँ बनीं। उपचार के 8 घंटे बाद सूक्ष्म रिक्तिकाएँ देखी गईं और 12 घंटे बाद उनकी संख्या में वृद्धि हुई। 14 घंटे बाद कई बड़ी रिक्तिकाएँ देखी गईं। उपचार के 12-16 घंटे बाद कई जुड़े हुए रिक्तिकाएँ स्पष्ट रूप से दिखाई देने लगीं, जो दर्शाता है कि रिक्तिकाओं का संलयन मीथेनोजेनिक मृत्यु तंत्र का आधार है। 20 घंटे बाद, पूरे कृमि में कई विशाल रिक्तिकाएँ पाई गईं। ये अवलोकन सी. एलिगेंस में मेट्यूओसिस की पहली रिपोर्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं।
5-आयोडोइंडोल-उपचारित कृमियों में, रिक्तिका एकत्रीकरण और टूटना भी देखा गया (चित्र 5), जैसा कि कृमि के मुड़ने और रिक्तिका के पर्यावरण में निकलने से प्रमाणित होता है। अंडे के छिलके की झिल्ली में रिक्तिका विघटन भी देखा गया, जिसे सामान्य रूप से हैचिंग के दौरान L2 द्वारा बरकरार रखा जाता है (पूरक चित्र S2)। ये अवलोकन रिक्तिका निर्माण और दमन की प्रक्रिया में द्रव संचय और ऑस्मोरेगुलेटरी विफलता, साथ ही प्रतिवर्ती कोशिका चोट (RCI) की भागीदारी का समर्थन करते हैं (चित्र 5)।
देखे गए रिक्तिका निर्माण में आयोडीन की भूमिका की परिकल्पना करते हुए, हमने सोडियम आयोडाइड (NaI) और पोटेशियम आयोडाइड (KI) की निमेटीसाइडल गतिविधि की जांच की। हालांकि, सांद्रता (0.1, 0.5 या 1 mM) पर, उन्होंने निमेटोड के अस्तित्व या रिक्तिका निर्माण (पूरक चित्र S5) को प्रभावित नहीं किया, हालांकि 1 mM KI का थोड़ा निमेटीसाइडल प्रभाव था। दूसरी ओर, 5-आयोडोइंडोल की तरह 7-आयोडोइंडोल (1 या 2 mM) ने कई रिक्तिकाएँ और संरचनात्मक विकृतियाँ प्रेरित कीं (पूरक चित्र S6)। दो आयोडोइंडोल ने पाइन निमेटोड में समान फेनोटाइपिक विशेषताएँ दिखाईं, जबकि NaI और KI ने नहीं। दिलचस्प बात यह है कि इंडोल ने परीक्षण की गई सांद्रता (डेटा नहीं दिखाया गया) पर B. ज़ाइलोफिलस में रिक्तिका निर्माण को प्रेरित नहीं किया। इस प्रकार, परिणामों ने पुष्टि की कि इंडोल-आयोडीन कॉम्प्लेक्स बी. ज़ाइलोफिलस के रिक्तिकाकरण और चयापचय के लिए जिम्मेदार है।
नेमाटोसाइडल गतिविधि के लिए परीक्षण किए गए इंडोल्स में, 5-आयोडोइंडोल में -5.89 kcal/mol का उच्चतम स्लिप इंडेक्स था, उसके बाद 7-आयोडोइंडोल (-4.48 kcal/mol), 4-फ्लुओरोइंडोल (-4.33) और इंडोल (-4.03) (चित्र 6) थे। 5-आयोडोइंडोल का ल्यूसीन 218 से मजबूत बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्डिंग इसके बंधन को स्थिर करता है, जबकि अन्य सभी इंडोल व्युत्पन्न साइड चेन हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से सेरीन 260 से बंधते हैं। अन्य मॉडल किए गए आयोडोइंडोल में, 2-आयोडोइंडोल का बंधन मूल्य -5.248 kcal/mol है, जो ल्यूसीन 218 के साथ इसके मुख्य हाइड्रोजन बंधन के कारण है। अन्य ज्ञात बंधनों में 3-आयोडोइंडोल (-4.3 kcal/mol), 4-आयोडोइंडोल (-4.0 kcal/mol) और 6-फ्लुओरोइंडोल (-2.6 kcal/mol) शामिल हैं (पूरक चित्र S8)। 5-आयोडोइंडोल और 2-आयोडोइंडोल के अपवाद के साथ अधिकांश हैलोजेनेटेड इंडोल और इंडोल स्वयं सेरीन 260 के साथ एक बंधन बनाते हैं। तथ्य यह है कि ल्यूसीन 218 के साथ हाइड्रोजन बॉन्डिंग कुशल रिसेप्टर-लिगैंड बाइंडिंग का संकेत है, जैसा कि आइवरमेक्टिन (पूरक चित्र S7) के लिए देखा गया है, यह पुष्टि करता है कि 5-आयोडोइंडोल और 2-आयोडोइंडोल, आइवरमेक्टिन की तरह, ल्यूसीन 218 (चित्र 6 और पूरक चित्र S8) के माध्यम से ग्लूसीएल रिसेप्टर की सक्रिय साइट से कसकर बंधे होते हैं। हम प्रस्ताव करते हैं कि यह बंधन ग्लूसीएल कॉम्प्लेक्स की खुली छिद्र संरचना को बनाए रखने के लिए आवश्यक है और ग्लूसीएल रिसेप्टर की सक्रिय साइट से कसकर बंधे होने से, 5-आयोडोइंडोल, 2-आयोडोइंडोल, एवरमेक्टिन और आइवरमेक्टिन इस प्रकार आयन चैनल को खुला रखते हैं और द्रव को अंदर जाने देते हैं।
इंडोल और हैलोजेनेटेड इंडोल का ग्लूसीएल से आणविक डॉकिंग। (ए) इंडोल, (बी) 4-फ्लोरोइंडोल, (सी) 7-आयोडोइंडोल और (डी) 5-आयोडोइंडोल लिगैंड्स के ग्लूसीएल के सक्रिय स्थल से बंधन अभिविन्यास। प्रोटीन को एक रिबन द्वारा दर्शाया गया है, और बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड को पीले रंग की बिंदीदार रेखाओं के रूप में दिखाया गया है। (ए′), (बी′), (सी′), और (डी′) आसपास के अमीनो एसिड अवशेषों के साथ संबंधित लिगैंड्स की अंतःक्रियाओं को दिखाते हैं, और साइड-चेन हाइड्रोजन बॉन्ड को गुलाबी बिंदीदार तीरों द्वारा दर्शाया गया है।
गोभी और मूली के बीजों के अंकुरण पर 5-आयोडोइंडोल के विषैले प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किए गए। 5-आयोडोइंडोल (0.05 या 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/mL) का आरंभिक अंकुरण और पौधों के उभरने पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 7)। इसके अलावा, अनुपचारित नियंत्रणों और 5-आयोडोइंडोल या एवरमेक्टिन से उपचारित बीजों की अंकुरण दर के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। मूल जड़ के विस्तार और बनने वाली पार्श्व जड़ों की संख्या पर प्रभाव नगण्य था, हालांकि 5-आयोडोइंडोल के 1 mM (इसकी सक्रिय सांद्रता का 10 गुना) ने पार्श्व जड़ों के विकास में थोड़ी देरी की। ये परिणाम संकेत देते हैं कि 5-आयोडोइंडोल पौधों की कोशिकाओं के लिए गैर विषैला है और अध्ययन की गई सांद्रता पर पौधों की विकास प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करता है।
बीज अंकुरण पर 5-आयोडोइंडोल का प्रभाव। एवरमेक्टिन या 5-आयोडोइंडोल के साथ या उसके बिना मुराशिगे और स्कोग अगर माध्यम पर बी. ओलेरेशिया और आर. राफेनिस्ट्रम के बीजों का अंकुरण, अंकुरण और पार्श्व जड़ें। 22 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के ऊष्मायन के बाद अंकुरण दर्ज किया गया।
इस अध्ययन में इंडोल द्वारा नेमाटोड को मारने के कई मामलों की रिपोर्ट की गई है। महत्वपूर्ण बात यह है कि आयोडोइंडोल द्वारा पाइन सुइयों में मिथाइलेशन (छोटे रिक्तिकाओं के संचय के कारण होने वाली प्रक्रिया जो धीरे-धीरे विशाल रिक्तिकाओं में विलीन हो जाती है, जिससे अंततः झिल्ली टूट जाती है और मृत्यु हो जाती है) को प्रेरित करने की यह पहली रिपोर्ट है, जिसमें आयोडोइंडोल वाणिज्यिक नेमाटोसाइड एवरमेक्टिन के समान महत्वपूर्ण नेमाटोसाइडल गुण प्रदर्शित करता है।
इंडोल्स को पहले प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स में कई सिग्नलिंग फ़ंक्शन करने के लिए रिपोर्ट किया गया है, जिसमें बायोफिल्म अवरोध/निर्माण, बैक्टीरियल अस्तित्व और रोगजनकता19,32,33,34 शामिल हैं। हाल ही में, हैलोजेनेटेड इंडोल्स, इंडोल एल्कलॉइड्स और सेमीसिंथेटिक इंडोल डेरिवेटिव्स के संभावित चिकित्सीय प्रभावों ने व्यापक शोध रुचि35,36,37 को आकर्षित किया है। उदाहरण के लिए, हैलोजेनेटेड इंडोल्स को लगातार एस्चेरिचिया कोली और स्टैफिलोकोकस ऑरियस कोशिकाओं को मारने के लिए दिखाया गया है37। इसके अलावा, अन्य प्रजातियों, जेनेरा और साम्राज्यों के खिलाफ हैलोजेनेटेड इंडोल्स की प्रभावकारिता का अध्ययन करना वैज्ञानिक रुचि का विषय है, और यह अध्ययन इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में एक कदम है।
यहाँ, हम सी. एलिगेंस में 5-आयोडोइंडोल-प्रेरित घातकता के लिए एक तंत्र का प्रस्ताव करते हैं जो प्रतिवर्ती कोशिका क्षति (RCI) और मिथाइलेशन (चित्र 4C और 5) पर आधारित है। सूजन और रिक्तिका अध:पतन जैसे एडेमेटस परिवर्तन RCI और मिथाइलेशन के संकेतक हैं, जो कोशिका द्रव्य में विशाल रिक्तिकाओं के रूप में प्रकट होते हैं48,49। RCI ATP उत्पादन को कम करके, ATPase पंप की विफलता का कारण बनकर, या कोशिका झिल्लियों को बाधित करके और Na+, Ca2+, और पानी50,51,52 के तेज़ प्रवाह का कारण बनकर ऊर्जा उत्पादन में बाधा डालता है। इंट्रासाइटोप्लाज़मिक रिक्तिकाएँ Ca2+ और पानी53 के प्रवाह के कारण कोशिका द्रव्य में द्रव संचय के परिणामस्वरूप पशु कोशिकाओं में उत्पन्न होती हैं। दिलचस्प बात यह है कि यदि क्षति अस्थायी है और कोशिकाएं एक निश्चित अवधि के लिए एटीपी का उत्पादन शुरू कर देती हैं, तो कोशिका क्षति की यह प्रक्रिया प्रतिवर्ती है, लेकिन यदि क्षति बनी रहती है या बिगड़ जाती है, तो कोशिकाएं मर जाती हैं।54 हमारे अवलोकनों से पता चलता है कि 5-आयोडोइंडोल से उपचारित नेमाटोड तनाव की स्थिति के संपर्क में आने के बाद सामान्य जैवसंश्लेषण को बहाल करने में असमर्थ हैं।
बी. ज़ाइलोफिलस में 5-आयोडोइंडोल द्वारा प्रेरित मिथाइलेशन फेनोटाइप आयोडीन की उपस्थिति और उसके आणविक वितरण के कारण हो सकता है, क्योंकि 7-आयोडोइंडोल का बी. ज़ाइलोफिलस पर 5-आयोडोइंडोल की तुलना में कम निरोधात्मक प्रभाव था (तालिका 1 और पूरक चित्र S6)। ये परिणाम माल्टीज़ एट अल. (2014) के अध्ययनों के साथ आंशिक रूप से सुसंगत हैं, जिन्होंने बताया कि इंडोल में पाइरिडाइल नाइट्रोजन के अंश को पैरा- से मेटा-स्थिति में स्थानांतरित करने से U251 कोशिकाओं में रिक्तिकाकरण, वृद्धि अवरोध और साइटोटॉक्सिसिटी समाप्त हो गई, जो यह दर्शाता है कि प्रोटीन में एक विशिष्ट सक्रिय साइट के साथ अणु की बातचीत महत्वपूर्ण है27,44,45। इस अध्ययन में देखी गई इंडोल या हैलोजेनेटेड इंडोल और ग्लूसीएल रिसेप्टर्स के बीच की अंतःक्रियाएं भी इस धारणा का समर्थन करती हैं, क्योंकि 5- और 2-आयोडोइंडोल को ग्लूसीएल रिसेप्टर्स से अन्य जांचे गए इंडोल की तुलना में अधिक मजबूती से बंधे हुए पाया गया (चित्र 6 और पूरक चित्र S8)। इंडोल के दूसरे या पांचवें स्थान पर आयोडीन को बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से ग्लूसीएल रिसेप्टर के ल्यूसीन 218 से बंधे हुए पाया गया, जबकि अन्य हैलोजेनेटेड इंडोल और इंडोल स्वयं सेरीन 260 के साथ कमजोर साइड-चेन हाइड्रोजन बॉन्ड बनाते हैं (चित्र 6)। इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि हैलोजेन का स्थानीयकरण वैक्यूलर डिजनरेशन के प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जबकि 5-आयोडोइंडोल का तंग बंधन आयन चैनल को खुला रखता है, जिससे तेजी से द्रव प्रवाह और वैक्यूल टूटना होता है। हालांकि, 5-आयोडोइंडोल की क्रिया का विस्तृत तंत्र अभी भी निर्धारित किया जाना बाकी है।
5-आयोडोइंडोल के व्यावहारिक अनुप्रयोग से पहले, पौधों पर इसके विषैले प्रभाव का विश्लेषण किया जाना चाहिए। हमारे बीज अंकुरण प्रयोगों से पता चला है कि अध्ययन की गई सांद्रता पर 5-आयोडोइंडोल का बीज अंकुरण या बाद की विकास प्रक्रियाओं पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं था (चित्र 7)। इस प्रकार, यह अध्ययन पाइन के पेड़ों के लिए पाइन नेमाटोड की हानिकारकता को नियंत्रित करने के लिए पारिस्थितिक वातावरण में 5-आयोडोइंडोल के उपयोग के लिए एक आधार प्रदान करता है।
पिछली रिपोर्टों ने दर्शाया है कि इंडोल-आधारित थेरेपी एंटीबायोटिक प्रतिरोध और कैंसर की प्रगति की समस्या को हल करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है55। इसके अलावा, इंडोल में जीवाणुरोधी, कैंसर विरोधी, एंटीऑक्सीडेंट, सूजनरोधी, मधुमेह विरोधी, एंटीवायरल, एंटीप्रोलिफेरेटिव और एंटीट्यूबरकुलोसिस गतिविधियाँ होती हैं और यह दवा विकास के लिए एक आशाजनक आधार के रूप में काम कर सकती हैं56,57। यह अध्ययन पहली बार आयोडीन के एंटीपैरासिटिक और एंटीहेल्मिंटिक एजेंट के रूप में संभावित उपयोग का सुझाव देता है।
एवरमेक्टिन की खोज तीन दशक पहले हुई थी और इसे 2015 में नोबेल पुरस्कार मिला था, और कृमिनाशक के रूप में इसका उपयोग अभी भी सक्रिय रूप से जारी है। हालाँकि, नेमाटोड और कीटों में एवरमेक्टिन के प्रति प्रतिरोध के तेजी से विकास के कारण, पाइन के पेड़ों में PWN संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए एक वैकल्पिक, कम लागत वाली और पर्यावरण के अनुकूल रणनीति की आवश्यकता है। यह अध्ययन उस तंत्र की भी रिपोर्ट करता है जिसके द्वारा 5-आयोडोइंडोल पाइन नेमाटोड को मारता है और 5-आयोडोइंडोल में पौधों की कोशिकाओं के लिए कम विषाक्तता होती है, जो इसके भविष्य के व्यावसायिक अनुप्रयोग के लिए अच्छी संभावनाएँ खोलती है।
सभी प्रयोगों को कोरिया के ग्योंगसान स्थित युंगनाम विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, तथा विधियों का निष्पादन युंगनाम विश्वविद्यालय की आचार समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।
अंडे के ऊष्मायन प्रयोग स्थापित प्रक्रियाओं का उपयोग करके किए गए43. हैचिंग दर (एचआर) का आकलन करने के लिए, 1-दिन के वयस्क नेमाटोड (लगभग 100 मादा और 100 नर) को फफूंद युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित किया गया और 24 घंटे तक बढ़ने दिया गया। फिर अंडों को अलग किया गया और बाँझ आसुत जल में निलंबन के रूप में 5-आयोडोइंडोल (0.05 mM और 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/ml) के साथ उपचारित किया गया। इन निलंबनों (500 μl; लगभग 100 अंडे) को 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट के कुओं में स्थानांतरित किया गया और 22 °C पर ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के 24 घंटे बाद L2 गणना की गई लेकिन अगर महीन प्लैटिनम तार से उत्तेजित होने पर कोशिकाएँ नहीं हिलीं तो उन्हें मृत माना गया। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया था, प्रत्येक में छह पुनरावृत्तियाँ थीं। दोनों प्रयोगों के डेटा को मिलाया गया और प्रस्तुत किया गया। एचआर का प्रतिशत इस प्रकार गणना किया जाता है:
पहले से विकसित प्रक्रियाओं का उपयोग करके लार्वा मृत्यु दर का आकलन किया गया। नेमाटोड अंडे एकत्र किए गए और भ्रूणों को L2 चरण के लार्वा उत्पन्न करने के लिए बाँझ आसुत जल में हैचिंग द्वारा सिंक्रनाइज़ किया गया। सिंक्रनाइज़ किए गए लार्वा (लगभग 500 नेमाटोड) को 5-आयोडोइंडोल (0.05 mM और 0.1 mM) या एवरमेक्टिन (10 μg/ml) के साथ उपचारित किया गया और B. सिनेरिया पेट्री प्लेटों पर पाला गया। 22 °C पर 48 घंटे के ऊष्मायन के बाद, नेमाटोड को बाँझ आसुत जल में एकत्र किया गया और L2, L3 और L4 चरणों की उपस्थिति के लिए जाँच की गई। L3 और L4 चरणों की उपस्थिति ने लार्वा परिवर्तन का संकेत दिया, जबकि L2 चरण की उपस्थिति ने कोई परिवर्तन नहीं होने का संकेत दिया। iRiS™ डिजिटल सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियाँ प्राप्त की गईं। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया था, प्रत्येक में छह पुनरावृत्तियाँ थीं। दोनों प्रयोगों के डेटा को मिलाया गया और प्रस्तुत किया गया।
मुराशिगे और स्कोग अगर प्लेटों पर अंकुरण परीक्षणों का उपयोग करके बीजों के लिए 5-आयोडोइंडोल और एवरमेक्टिन की विषाक्तता का आकलन किया गया।62 बी. ओलेरेशिया और आर. राफेनीस्ट्रम के बीजों को पहले एक दिन के लिए बाँझ आसुत जल में भिगोया गया, 1 मिली 100% इथेनॉल से धोया गया, 1 मिली 50% वाणिज्यिक ब्लीच (3% सोडियम हाइपोक्लोराइट) के साथ 15 मिनट के लिए बाँझ बनाया गया, और 1 मिली बाँझ पानी से पाँच बार धोया गया। बाँझ बीजों को फिर 0.86 ग्राम/ली (0.2X) मुराशिगे और स्कोग माध्यम और 0.7% जीवाणु संबंधी अगर युक्त अंकुरण अगर प्लेटों पर दबाया गया, जिसमें 5-आयोडोइंडोल या एवरमेक्टिन हो या न हो। फिर प्लेटों को 22 °C पर इनक्यूबेट किया गया, और 3 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद तस्वीरें ली गईं। यह प्रयोग दो चरणों में किया गया, जिनमें से प्रत्येक में छह पुनरावृत्तियाँ थीं।