पौधों की सूक्ष्मनलिकाओं को प्रभावित करने वाले नए पौध वृद्धि अवरोधकों के रूप में उर्सा मोनोमाइड्स की खोज, लक्षण-वर्णन और कार्यात्मक सुधार।

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प्राकृतिक उत्पादों की खोज और लाभकारी उपयोग मानव जीवन को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं। पौधों की वृद्धि अवरोधक रसायनों का व्यापक रूप से खरपतवारों को नियंत्रित करने के लिए शाकनाशियों के रूप में उपयोग किया जाता है। विभिन्न प्रकार के शाकनाशियों का उपयोग करने की आवश्यकता के कारण, क्रिया के नए तंत्र वाले यौगिकों की पहचान करने की आवश्यकता है। इस अध्ययन में, हमने स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेंसिस MK493-CF1 से एक नया N-अल्कोक्सीपाइरोल यौगिक, कौमामोनामाइड की खोज की और संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया की स्थापना की। जैविक गतिविधि परख के माध्यम से, हमने पाया कि urs-monoamic एसिड urs-monoamide का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती है और एक संभावित हैपौध वृद्धि अवरोधकइसके अलावा, हमने कई अर्बेनोनिक एसिड डेरिवेटिव विकसित किए हैं, जिनमें अर्बेनिलॉक्सी डेरिवेटिव (यूडीए) शामिल है, जिसमें हेला कोशिकाओं की वृद्धि को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना उच्च शाकनाशी गतिविधि होती है। हमने यह भी पाया कि उर्मोटोनिक एसिड डेरिवेटिव पौधे के सूक्ष्मनलिका को बाधित करते हैं; इसके अलावा, केएएनडी एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है; ये बहुआयामी प्रभाव ज्ञात सूक्ष्मनलिका अवरोधकों से भिन्न हैं और उर्सोनिक एसिड के लिए कार्रवाई के एक नए तंत्र का सुझाव देते हैं, जो नए शाकनाशियों के विकास में एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।
लाभकारी प्राकृतिक उत्पादों और उनके व्युत्पन्नों की खोज और व्यावहारिक अनुप्रयोग मानव जीवन की गुणवत्ता में सुधार का एक साधन है। सूक्ष्मजीवों, पौधों और कीड़ों द्वारा उत्पादित द्वितीयक मेटाबोलाइट्स ने चिकित्सा और कृषि में बड़ी प्रगति की है। प्राकृतिक उत्पादों से कई एंटीबायोटिक्स और एंटी-ल्यूकेमिया दवाएं विकसित की गई हैं। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार केकीटनाशककृषि में उपयोग के लिए इन प्राकृतिक उत्पादों से कवकनाशी और शाकनाशी निकाले जाते हैं। विशेष रूप से, खरपतवार नियंत्रण शाकनाशी आधुनिक कृषि में फसल की पैदावार बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं, और विभिन्न प्रकार के यौगिकों का पहले से ही व्यावसायिक रूप से उपयोग किया जा रहा है। पौधों में कई कोशिकीय प्रक्रियाएँ, जैसे प्रकाश संश्लेषण, अमीनो एसिड चयापचय, कोशिका भित्ति संश्लेषण, माइटोसिस का विनियमन, फाइटोहोर्मोन सिग्नलिंग, या प्रोटीन संश्लेषण, शाकनाशियों के विशिष्ट लक्ष्य माने जाते हैं। सूक्ष्मनलिका कार्य को बाधित करने वाले यौगिक शाकनाशियों का एक सामान्य वर्ग है जो माइटोटिक विनियमन को प्रभावित करके पौधों की वृद्धि को प्रभावित करते हैं2.
सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन के घटक हैं और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से संरक्षित हैं। ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर में α-ट्यूबुलिन और β-ट्यूबुलिन होते हैं जो रैखिक सूक्ष्मनलिका प्रोटोफिलामेंट बनाते हैं, जिसमें 13 प्रोटोफिलामेंट एक बेलनाकार संरचना बनाते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं पादप कोशिकाओं में कई भूमिकाएँ निभाती हैं, जिसमें कोशिका का आकार, कोशिका विभाजन और अंतःकोशिकीय परिवहन3,4 निर्धारित करना शामिल है। पादप कोशिकाओं में इंटरफेज़ प्लाज़्मा झिल्ली के नीचे सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, और इन तथाकथित कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं को सेल्यूलोज़ सिंथेस कॉम्प्लेक्स4,5 के विनियमन के माध्यम से सेल्यूलोज़ माइक्रोफ़ाइब्रिल्स के संगठन को नियंत्रित करने के लिए माना जाता है। जड़ की एपिडर्मल कोशिकाओं के कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं, जड़ की नोक के तेज़ विस्तार के क्षेत्र में मौजूद होती हैं, पार्श्व में स्थित होती हैं, और सेल्यूलोज़ माइक्रोफ़ाइबर इन सूक्ष्मनलिकाओं का अनुसरण करते हैं और कोशिका विस्तार की दिशा को सीमित करते हैं, जिससे अनिसोट्रोपिक कोशिका विस्तार को बढ़ावा मिलता है। इसलिए, सूक्ष्मनलिका का कार्य पादप आकृति विज्ञान से निकटता से संबंधित है। ट्यूबुलिन को एनकोड करने वाले जीन में एमिनो एसिड प्रतिस्थापन कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल सरणियों के तिरछेपन और अरेबिडोप्सिस 6,7 में बाएं या दाएं तरफा वृद्धि का कारण बनता है। इसी तरह, माइक्रोट्यूब्यूल-संबंधित प्रोटीन में उत्परिवर्तन जो माइक्रोट्यूब्यूल गतिशीलता को नियंत्रित करते हैं, वे भी विकृत जड़ वृद्धि 8,9,10,11,12,13 का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, माइक्रोट्यूब्यूल-विघटनकारी शाकनाशियों जैसे कि डिसोपाइरामाइड, जिसे प्रीटिलाक्लोर के रूप में भी जाना जाता है, के साथ उपचार भी बाएं तरफा तिरछी जड़ वृद्धि 14 का कारण बनता है। ये डेटा संकेत देते हैं कि पौधे की वृद्धि की दिशा निर्धारित करने के लिए माइक्रोट्यूब्यूल फ़ंक्शन का सटीक विनियमन महत्वपूर्ण है।
विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मनलिका अवरोधकों की खोज की गई है, और इन दवाओं ने साइटोस्केलेटल अनुसंधान के साथ-साथ कृषि और चिकित्सा में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। विशेष रूप से, ओरिज़ालिन, डाइनिट्रोएनिलिन यौगिक, डिसोपाइरामाइड, बेंजामाइड-संबंधित यौगिक और उनके एनालॉग सूक्ष्मनलिका कार्य को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार पौधे की वृद्धि को बाधित कर सकते हैं। इसलिए, उन्हें व्यापक रूप से शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है। हालाँकि, चूँकि सूक्ष्मनलिकाएँ पौधे और पशु कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घटक हैं, इसलिए अधिकांश सूक्ष्मनलिका अवरोधक दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक हैं। इसलिए, शाकनाशी के रूप में उनकी मान्यता प्राप्त उपयोगिता के बावजूद, व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए सीमित संख्या में एंटीमाइक्रोट्यूब्यूल एजेंटों का उपयोग किया जाता है।
स्ट्रेप्टोमाइसेस स्ट्रेप्टोमाइसेस परिवार का एक जीनस है, जिसमें एरोबिक, ग्राम-पॉजिटिव, फिलामेंटस बैक्टीरिया शामिल हैं और व्यापक रूप से द्वितीयक मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्पादन करने की अपनी क्षमता के लिए जाना जाता है। इसलिए, इसे नए जैविक रूप से सक्रिय प्राकृतिक उत्पादों के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक माना जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने कौमामोनमाइड नामक एक नए यौगिक की खोज की, जिसे स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेंसिस MK493-CF1 और एस. वेरेंसिस ISP 5486 से अलग किया गया था। स्पेक्ट्रल विश्लेषण और पूर्ण स्पेक्ट्रल विश्लेषण का उपयोग करके, कौमामोनमाइड की संरचना की विशेषता बताई गई और इसके अद्वितीय एन-एल्कोक्सीपाइरोल कंकाल का निर्धारण किया गया। संश्लेषण। उर्समोनोमाइड और इसके व्युत्पन्नों का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती, उर्समोनिक एसिड, लोकप्रिय मॉडल पौधे अरेबिडोप्सिस थालियाना के विकास और अंकुरण को बाधित करने के लिए पाया गया था। संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन में, हमने पाया कि C9 के साथ एक यौगिक जिसे उर्सोनिक एसिड में संशोधित किया गया है, जिसे उर्सोनिक एसिड का नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (KAND) कहा जाता है, विकास और अंकुरण पर निरोधात्मक प्रभाव को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है। उल्लेखनीय रूप से, नए खोजे गए पौधे विकास अवरोधक ने तंबाकू और लिवरवॉर्ट के विकास को भी प्रभावित किया और यह बैक्टीरिया या हेला कोशिकाओं के लिए साइटोटॉक्सिक नहीं था। इसके अलावा, कुछ उर्मोटोनिक एसिड व्युत्पन्न एक विकृत रूट फेनोटाइप को प्रेरित करते हैं, जिसका अर्थ है कि ये व्युत्पन्न सीधे या अप्रत्यक्ष रूप से माइक्रोट्यूब्यूल को प्रभावित करते हैं। इस विचार के अनुरूप, इम्यूनोहिस्टोकेमिकली या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए माइक्रोट्यूब्यूल के हमारे अवलोकन से संकेत मिलता है कि KAND उपचार माइक्रोट्यूब्यूल को डीपॉलीमराइज़ करता है। इसके अलावा, कुमामोटोनिक एसिड व्युत्पन्न के साथ उपचार ने एक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स को बाधित कर दिया। इस प्रकार, हमने एक नए पौधे विकास अवरोधक की खोज की है जिसकी क्रिया के अनूठे तंत्र में साइटोस्केलेटन का विनाश शामिल है।
टोक्यो के शिनागावा-कु में मिट्टी से MK493-CF1 स्ट्रेन को अलग किया गया। स्ट्रेन MK493-CF1 ने अच्छी तरह से शाखित स्ट्रोमल माइसेलियम का निर्माण किया। 16S राइबोसोमल RNA जीन (1422 bp) का आंशिक अनुक्रम निर्धारित किया गया। यह स्ट्रेन S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: विशिष्ट स्ट्रेन, 99.93%) से बहुत मिलता-जुलता है। इस परिणाम के आधार पर, यह निर्धारित किया गया कि यह स्ट्रेन S. werraensis के प्रकार के स्ट्रेन से बहुत निकटता से संबंधित था। इसलिए, हमने इस स्ट्रेन को अनंतिम रूप से S. werraensis MK493-CF1 नाम दिया। S. werraensis ISP 5486T भी समान जैवसक्रिय यौगिक बनाता है। चूंकि इस सूक्ष्मजीव से प्राकृतिक उत्पाद प्राप्त करने के लिए बहुत कम प्रारंभिक शोध हुआ था, इसलिए आगे रासायनिक शोध किया गया। 14 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ठोस अवस्था किण्वन द्वारा जौ माध्यम पर एस. वेरेंसिस एमके493-सीएफ1 की खेती के बाद, माध्यम को 50% ईटीओएच के साथ निकाला गया। 59.5 मिलीग्राम कच्चे अर्क को प्राप्त करने के लिए 60 मिलीलीटर नमूने को सुखाया गया। कच्चे अर्क को रिवर्स फेज एचपीएलसी के अधीन किया गया ताकि एन-मेथॉक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड (1, जिसे कौमामोनमाइड कहा जाता है, 36.0 मिलीग्राम) प्राप्त हो। 1 की कुल मात्रा कच्चे अर्क का लगभग 60% है। इसलिए, हमने कुमामोटोमाइड 1 के गुणों का विस्तार से अध्ययन करने का फैसला किया।
कौमामोनमाइड 1 एक सफेद अनाकार पाउडर है और उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 (चित्र 1) की पुष्टि करता है। इस यौगिक के C2-प्रतिस्थापित पाइरोल खंड की विशेषता δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR स्पेक्ट्रम में: 4.5 Hz, H-5) और δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) है, और 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन परमाणुओं की उपस्थिति दर्शाता है। C2 स्थिति पर एक एमाइड समूह की उपस्थिति का आकलन C-3 प्रोटॉन से δC 161.1 पर एमाइड कार्बोनिल कार्बन तक HMBC सहसंबंध द्वारा किया गया था। इसके अलावा, δH 4.10 (3H, S) और δC 68.3 पर 1 H और 13 C NMR शिखर अणु में N-मेथॉक्सी समूहों की उपस्थिति का संकेत देते हैं। हालाँकि मेथॉक्सी समूह की सही स्थिति अभी तक स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण जैसे कि संवर्धित अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु ओवरहॉसर संक्षिप्तीकरण (NOEDF) का उपयोग करके निर्धारित नहीं की गई थी, N-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड पहला उम्मीदवार यौगिक बन गया।
1 की सही संरचना निर्धारित करने के लिए, कुल संश्लेषण किया गया (चित्र 2a)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-एमिनोपाइरीडीन 2 का m-CPBA के साथ उपचार करने से मात्रात्मक उपज में संबंधित N-ऑक्साइड 3 प्राप्त हुआ। 2 के 2-एमिनोएज़िडेशन के बाद, अब्रामोविच द्वारा वर्णित साइक्लोकंडेंसेशन प्रतिक्रिया को 90°C पर बेंजीन में किया गया ताकि वांछित 1-हाइड्रॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोनाइट्राइल 5 ग्राम में प्राप्त किया जा सके। गति 60% (दो चरण)। 15,16. 4 के मिथाइलेशन और हाइड्रोलिसिस ने फिर 1-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (जिसे "क्यूमोटोनिक एसिड" कहा जाता है, 6) अच्छी उपज (70%, दो चरण) में दिया। अंत में, संश्लेषित 1 के सभी वर्णक्रमीय डेटा पृथक 1 के समान थे, इसलिए 1 की संरचना निर्धारित की गई;
अर्बेनामाइड और अर्बेनिक एसिड की जैविक गतिविधि का सामान्य संश्लेषण और विश्लेषण। (ए) कुमामोटो एमाइड का कुल संश्लेषण। (बी) सात दिन पुराने जंगली प्रकार के एराबिडोप्सिस कोलंबिया (कोल) के पौधों को मुराशिगे और स्कोग (एमएस) प्लेटों पर उगाया गया, जिसमें संकेतित सांद्रता पर कौमामोनामाइड 6 या कौमामोनामाइड 1 था। स्केल बार = 1 सेमी।
सबसे पहले, हमने पौधों की वृद्धि को नियंत्रित करने की उनकी क्षमता के लिए अर्बेनमाइड और उसके मध्यवर्ती पदार्थों की जैविक गतिविधियों का मूल्यांकन किया। हमने एमएस अगर माध्यम में उर्सोनामाइड 1 या उर्सोमोनिक एसिड 6 की विभिन्न सांद्रताएँ डालीं और इस माध्यम पर अरेबिडोप्सिस थैलियाना के पौधों को उगाया। इन परीक्षणों से पता चला कि 6 की उच्च सांद्रता (500 μM) ने जड़ की वृद्धि को बाधित किया (चित्र 2b)। इसके बाद, हमने 6 के N1 स्थान को प्रतिस्थापित करके विभिन्न व्युत्पन्न उत्पन्न किए और उन पर संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन किए (एनालॉग संश्लेषण प्रक्रिया सहायक सूचना (SI) में वर्णित है)। अरेबिडोप्सिस के पौधों को 50 μM उर्सोनिक एसिड व्युत्पन्न युक्त माध्यम पर उगाया गया और जड़ की लंबाई मापी गई। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 3a, b, और S1 में दिखाया गया है, कौमामो एसिड में रैखिक एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (9, 10, 11, 12, और 13) या N1 स्थिति पर बड़ी एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (15, 16, और 17) की अलग-अलग लंबाई होती है। व्युत्पन्नों ने जड़ वृद्धि का महत्वपूर्ण अवरोध दिखाया। इसके अलावा, हमने पाया कि 200 μM 10, 11, या 17 के अनुप्रयोग ने अंकुरण को बाधित किया (चित्र 3c और S2)।
कुमामोटो एमाइड और संबंधित यौगिकों के संरचना-गतिविधि संबंध का अध्ययन। (ए) एनालॉग्स की संरचना और संश्लेषण योजना। (बी) 50 μM कुमामोनामाइड व्युत्पन्नों के साथ या बिना एमएस माध्यम पर उगाए गए 7-दिन पुराने पौधों की जड़ की लंबाई का परिमाणीकरण। तारांकन शम उपचार (टी परीक्षण, पी) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं< 0.05). एन>18. डेटा को औसत ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। एनटी का अर्थ है "परीक्षण नहीं किया गया" क्योंकि 50% से अधिक बीज अंकुरित नहीं हुए। (सी) 200 μM कौमामोनमाइड और संबंधित यौगिकों के साथ या बिना एमएस माध्यम में 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट किए गए उपचारित बीजों की अंकुरण दर का परिमाणीकरण। तारांकन शम उपचार (ची-स्क्वायर परीक्षण) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। n=96।
दिलचस्प बात यह है कि C9 से अधिक लम्बी एल्काइल साइड चेन के जुड़ने से निरोधात्मक गतिविधि कम हो गई, जिससे पता चलता है कि कुमामोटोइक एसिड से संबंधित यौगिकों को अपनी जैविक गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए एक निश्चित आकार की साइड चेन की आवश्यकता होती है।
क्योंकि संरचना-गतिविधि संबंध विश्लेषण से पता चला कि C9 को उर्सोनिक एसिड में बदल दिया गया था और उर्सोनिक एसिड का नॉनऑक्सी व्युत्पन्न (जिसे बाद में KAND 11 के रूप में संदर्भित किया गया) सबसे प्रभावी पौधा वृद्धि अवरोधक था, इसलिए हमने KAND 11 का अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन किया। 50 μM KAND 11 के साथ अरेबिडोप्सिस का उपचार लगभग पूरी तरह से अंकुरण को रोकता है, जबकि KAND 11 की कम सांद्रता (40, 30, 20, या 10 μM) ने खुराक पर निर्भर तरीके से जड़ की वृद्धि को बाधित किया (चित्र 4a, b)। यह जांचने के लिए कि क्या KAND 11 रूट मेरिस्टेम व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, हमने प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) के साथ दागे गए रूट मेरिस्टेम की जांच की और मेरिस्टेम क्षेत्र के आकार को मापा। 25 μM KAND-11 युक्त माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 151.1 ± 32.5 μm था, जबकि DMSO युक्त नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 264.7 ± 30.8 μm था (चित्र 4c, d), जो दर्शाता है कि KAND-11 कोशिकीय गतिविधि को पुनर्स्थापित करता है। फैल रहा है। रूट मेरिस्टेम। इसके अनुरूप, KAND 11 उपचार ने रूट मेरिस्टेम (चित्र 4e) 17 में सेल डिवीजन मार्कर CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS सिग्नल की मात्रा कम कर दी। ये परिणाम दर्शाते हैं कि KAND 11 कोशिका प्रसार गतिविधि को कम करके जड़ विकास को बाधित करता है।
विकास पर अर्बेनोनिक एसिड व्युत्पन्न (अर्बेनिलॉक्सी व्युत्पन्न) के निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण। (ए) 7-दिन पुराने जंगली प्रकार के कोल अंकुर एमएस प्लेटों पर KAND 11 की संकेतित सांद्रता के साथ उगाए गए। स्केल बार = 1 सेमी। (बी) जड़ की लंबाई का परिमाणीकरण। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी एचएसडी परीक्षण, पी< 0.05). एन>16. डेटा को औसत ± SD के रूप में दिखाया गया है। (c) 25 μM KAND के साथ या उसके बिना MS प्लेट पर उगाई गई प्रोपिडियम आयोडाइड-रंजित जंगली-प्रकार कोल जड़ों की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 11. सफ़ेद कोष्ठक रूट मेरिस्टेम को दर्शाते हैं। स्केल बार = 100 µm. (d) रूट मेरिस्टेम आकार का परिमाणीकरण (n = 10 से 11)। सांख्यिकीय अंतर t-परीक्षण (p) का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे< 0.05)। पट्टियाँ औसत मेरिस्टेम आकार को दर्शाती हैं। (ई) सीडीकेबी2 संरचना वाले रूट मेरिस्टेम की विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी; 1प्रो: सीडीकेबी2; 1-जीयूएस अभिरंजित और 25 µM केएएनडी परख के साथ या उसके बिना एमएस प्लेटों पर उगाए गए 5-दिन पुराने पौधों पर अभिरंजित।
KAND 11 की फाइटोटॉक्सिसिटी का परीक्षण एक अन्य द्विबीजपत्री पौधे, तम्बाकू (निकोटियाना टैबैकम) और एक प्रमुख भूमि संयंत्र मॉडल जीव, लिवरवॉर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमोर्फा) का उपयोग करके किया गया। अरेबिडोप्सिस के मामले में, 25 μM KAND 11 युक्त माध्यम पर उगाए गए तम्बाकू SR-1 के पौधों ने छोटी जड़ें पैदा कीं (चित्र 5a)। इसके अतिरिक्त, 48 में से 40 बीज 200 μM KAND 11 युक्त प्लेटों पर अंकुरित हुए, जबकि सभी 48 बीज नकली उपचारित माध्यम पर अंकुरित हुए, जो दर्शाता है कि KAND की उच्च सांद्रता महत्वपूर्ण थी (पी< 0.05; ची परीक्षण-वर्ग) ने तंबाकू के अंकुरण को बाधित किया। (चित्र 5 बी)। इसके अलावा, KAND 11 की सांद्रता जिसने लिवरवॉर्ट में बैक्टीरिया के विकास को बाधित किया, वह अरेबिडोप्सिस (चित्र 5 सी) में प्रभावी सांद्रता के समान थी। ये परिणाम संकेत देते हैं कि KAND 11 विभिन्न प्रकार के पौधों की वृद्धि को बाधित कर सकता है। हमने फिर अन्य जीवों में भालू मोनोमाइड-संबंधित यौगिकों की संभावित साइटोटोक्सिसिटी की जांच की, अर्थात् मानव हेला कोशिकाएं और एस्चेरिचिया कोली स्ट्रेन DH5α, क्रमशः उच्च पशु और बैक्टीरिया कोशिकाओं के प्रतिनिधियों के रूप में। सेल प्रसार परख की एक श्रृंखला में, हमने देखा कि कौमामोनामाइड 1, कौमामोनामिडिक एसिड 6, और KAND 11 ने 100 μM (चित्र 5 डी, ई) की सांद्रता पर हेला या ई कोली कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं किया।
गैर-अरबीडोप्सिस जीवों में KAND 11 की वृद्धि अवरोधन। (a) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार SR-1 तम्बाकू के पौधों को 25 μM KAND 11 युक्त लंबवत स्थित MS प्लेटों पर उगाया गया। (b) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार SR-1 तम्बाकू के पौधों को 200 μM KAND 11 युक्त क्षैतिज रूप से स्थित MS प्लेटों पर उगाया गया। (c) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार Tak-1 लिवरवॉर्ट कलियों को KAND 11 की संकेतित सांद्रता के साथ गैम्बर्ग B5 प्लेटों पर उगाया गया। लाल तीर उन बीजाणुओं को इंगित करते हैं जो दो सप्ताह की ऊष्मायन अवधि के भीतर बढ़ना बंद कर देते हैं। (d) हेला कोशिकाओं का कोशिका प्रसार परख। विश्लेषण तीन प्रतियों में किए गए। (ई) ई. कोली कोशिका प्रसार परख। ई. कोली वृद्धि का विश्लेषण OD600 मापकर किया गया। नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को 50 μg/ml एम्पीसिलीन (एम्प) से उपचारित किया गया, जो बैक्टीरिया कोशिका भित्ति संश्लेषण को रोकता है। विश्लेषण तीन प्रतियों में किए गए।
यूरामाइड-संबंधी यौगिकों की वजह से होने वाली साइटोटॉक्सिसिटी की क्रियाविधि को समझने के लिए, हमने मध्यम निरोधात्मक प्रभावों के साथ अर्बेनिक एसिड डेरिवेटिव का पुनः विश्लेषण किया। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 2b, 6a में दिखाया गया है, उर्मोटोनिक एसिड 6 की उच्च सांद्रता (200 μM) वाले अगर प्लेटों पर उगाए गए पौधों ने छोटी और बाएं-मुड़ जड़ें (θ = - 23.7 ± 6.1) उत्पन्न की, जबकि नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों में, पौधों ने लगभग सीधी जड़ें (θ = - 3.8 ± 7.1) उत्पन्न की। यह विशिष्ट तिरछी वृद्धि कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स14,18 की शिथिलता के परिणामस्वरूप ज्ञात है। इस खोज के अनुरूप, माइक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करने वाली दवाएं डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन उसी समय, हमने उर्मोटोनिक एसिड व्युत्पन्नों का परीक्षण किया और उनमें से कई का चयन किया, जो निश्चित सांद्रता पर तिरछी जड़ वृद्धि को प्रेरित करते थे। यौगिक 8, 9 और 15 ने क्रमशः 75 μM, 50 μM और 40 μM पर जड़ वृद्धि की दिशा बदल दी, जो दर्शाता है कि ये यौगिक प्रभावी रूप से सूक्ष्मनलिकाएं को अस्थिर कर सकते हैं (चित्र 2बी, 6ए)। हमने सबसे शक्तिशाली उर्सोलिक एसिड व्युत्पन्न, KAND 11 का भी कम सांद्रता (15 µM) पर परीक्षण किया और पाया कि KAND 11 के प्रयोग से जड़ की वृद्धि बाधित हुई और जड़ की वृद्धि की दिशा असमान थी, हालांकि वे बाईं ओर झुकी हुई थीं (चित्र C3)। 25 μM KAND 11 से उपचारित अंकुर जड़ों की एपिडर्मल कोशिकाओं में एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने विस्तार क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में लगभग सभी कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के गायब होने को दिखाया (चित्र 6 बी)। ये परिणाम संकेत देते हैं कि कुमामोटोनिक एसिड और इसके व्युत्पन्न माइक्रोट्यूब्यूल्स पर सीधे या परोक्ष रूप से कार्य करते हैं और उन्हें बाधित करते हैं और ये यौगिक नए माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधक हैं।
उर्सोनिक एसिड और इसके व्युत्पन्न एराबिडोप्सिस थालियाना में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स को बदलते हैं। (ए) संकेतित सांद्रता पर विभिन्न उर्मोटोनिक एसिड व्युत्पन्नों की उपस्थिति में मापा गया रूट झुकाव कोण। माइक्रोट्यूब्यूल्स को बाधित करने वाले दो यौगिकों के प्रभावों का भी विश्लेषण किया गया: डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन। इनसेट रूट ग्रोथ एंगल को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक को दर्शाता है। तारांकन शम उपचार (टी परीक्षण, पी) के साथ महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करते हैं< 0.05). एन>19. स्केल बार = 1 सेमी. (बी) बढ़ाव क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स। 25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाए गए जंगली-प्रकार के अरेबिडोप्सिस कोल जड़ों में माइक्रोट्यूब्यूल्स को β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी और एलेक्सा फ्लुओर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन द्वारा देखा गया। स्केल बार = 10 µm. (सी) रूट मेरिस्टेम में माइक्रोट्यूब्यूल्स की माइटोटिक संरचना। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन का उपयोग करके माइक्रोट्यूब्यूल्स को देखा गया। प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ़्रैग्मोप्लास्ट सहित माइटोटिक संरचनाओं को कॉन्फ़ोकल छवियों से गिना गया। तीर माइटोटिक माइक्रोट्यूब्यूल संरचनाओं को इंगित करते हैं। तारांकन शम उपचार (टी परीक्षण, पी) के साथ महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करते हैं< 0.05). एन>9. स्केल बार = 50 µm.
हालाँकि उर्सा में माइक्रोट्यूब्यूल फ़ंक्शन को बाधित करने की क्षमता है, लेकिन इसकी क्रियाविधि सामान्य माइक्रोट्यूब्यूल डीपोलीमराइज़िंग एजेंट से अलग होने की उम्मीद है। उदाहरण के लिए, डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन जैसे माइक्रोट्यूब्यूल डीपोलीमराइज़िंग एजेंट की उच्च सांद्रता एपिडर्मल कोशिकाओं के अनिसोट्रोपिक विस्तार को प्रेरित करती है, जबकि KAND 11 ऐसा नहीं करता है। इसके अलावा, KAND 11 और डिसोपाइरामाइड के सह-अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप डिसोपाइरामाइड-प्रेरित जड़ वृद्धि प्रतिक्रिया हुई और KAND 11-प्रेरित वृद्धि अवरोध देखा गया (चित्र S4)। हमने KAND 11 के प्रति अतिसंवेदनशील डिसोपाइरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्ती की प्रतिक्रिया का भी विश्लेषण किया। phs1-1 में एक गैर-विहित ट्यूबुलिन किनेज बिंदु उत्परिवर्तन होता है और डिसोपाइरामाइड9,20 के साथ उपचारित होने पर छोटी जड़ें पैदा करता है। के.ए.एन.डी. 11 युक्त अगर माध्यम पर उगाए गए phs1-1 उत्परिवर्ती पौधों की जड़ें डिसोपाइरामिड पर उगाए गए पौधों के समान छोटी थीं (चित्र एस5)।
इसके अलावा, हमने KAND 11 के साथ इलाज किए गए पौधों की जड़ मेरिस्टेम में प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ़्रेग्मोप्लास्ट जैसे माइटोटिक माइक्रोट्यूब्यूल संरचनाएं देखीं। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS के अवलोकनों के अनुरूप, माइटोटिक माइक्रोट्यूब्यूल की संख्या में उल्लेखनीय कमी देखी गई (चित्र.6c)।
सबसेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर KAND 11 की साइटोटॉक्सिसिटी को चिह्नित करने के लिए, हमने KAND 11 के साथ तंबाकू BY-2 सस्पेंशन कोशिकाओं का इलाज किया और उनकी प्रतिक्रिया देखी। हमने सबसे पहले KAND 11 को TagRFP-TUA6 व्यक्त करने वाली BY-2 कोशिकाओं में जोड़ा, जो फ्लोरोसेंट रूप से माइक्रोट्यूब्यूल्स को लेबल करता है, ताकि कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल पर KAND 11 के प्रभाव का आकलन किया जा सके। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल घनत्व का आकलन छवि विश्लेषण का उपयोग करके किया गया, जिसने साइटोप्लाज्मिक पिक्सल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सल के प्रतिशत को निर्धारित किया। परख के नतीजों से पता चला कि 1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 के साथ उपचार के बाद, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% या 0.23 ± 0.28% तक काफी कम हो गया ये परिणाम अरेबिडोप्सिस में अवलोकन के अनुरूप हैं कि KAND 11 उपचार कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स (चित्र 6b) के डीपोलीमराइजेशन को प्रेरित करता है। हमने KAND 11 की समान सांद्रता के साथ उपचार के बाद GFP-ABD-लेबल वाले एक्टिन फिलामेंट्स के साथ BY-2 लाइन की भी जांच की और पाया कि KAND 11 उपचार ने एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित कर दिया। 1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 के साथ उपचार ने एक्टिन फिलामेंट घनत्व को क्रमशः 1.20 ± 0.62% या 0.61 ± 0.26% तक कम कर दिया, जबकि DMSO-उपचारित कोशिकाओं में घनत्व 1.69 ± 0.51% था (चित्र 2)। ये परिणाम प्रोपीज़ामाइड के प्रभावों के विपरीत हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित नहीं करता है, और लैट्रुनकुलिन बी, एक एक्टिन डिपोलीमराइज़र जो माइक्रोट्यूब्यूल्स को प्रभावित नहीं करता है (एसआई चित्र एस 6)। इसके अलावा, कौमामोनामाइड 1, कौमामोनामाइड एसिड 6, या केएएनडी 11 के साथ उपचार ने हेला कोशिकाओं में माइक्रोट्यूब्यूल्स को प्रभावित नहीं किया (एसआई चित्र एस 7)। इस प्रकार, केएएनडी 11 की क्रियाविधि ज्ञात साइटोस्केलेटन डिसरप्टर्स से भिन्न मानी जाती है। इसके अलावा, KAND 11 से उपचारित BY-2 कोशिकाओं के हमारे सूक्ष्म अवलोकन से KAND 11 उपचार के दौरान कोशिका मृत्यु की शुरुआत का पता चला और दिखाया कि KAND 11 उपचार के 30 मिनट बाद इवांस ब्लू-स्टेन्ड मृत कोशिकाओं का अनुपात काफी हद तक नहीं बढ़ा, जबकि 50 μM या 100 μM KAND के साथ 90 मिनट के उपचार के बाद, मृत कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 43.7% या 80.1% तक बढ़ गई (चित्र 7c)। एक साथ लिया गया, ये डेटा संकेत देते हैं कि नया उर्सोलिक एसिड व्युत्पन्न KAND 11 एक पौधा-विशिष्ट साइटोस्केलेटल अवरोधक है जिसमें पहले से अज्ञात क्रियाविधि है।
KAND कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल, एक्टिन फिलामेंट्स और तंबाकू BY-2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। (ए) TagRFP-TUA6 की उपस्थिति में BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल का दृश्य। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO के साथ उपचारित BY-2 कोशिकाओं की जांच कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल घनत्व की गणना 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से की गई। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी HSD परीक्षण, पी< 0.05)। स्केल बार = 10 µm. (b) GFP-ABD2 की मौजूदगी में देखे गए BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं की जांच कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई। कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट के घनत्व की गणना 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से की गई। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी HSD परीक्षण, पृष्ठ< 0.05)। स्केल बार = 10 µm. (c) इवांस ब्लू स्टेनिंग द्वारा मृत BY-2 कोशिकाओं का अवलोकन। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO के साथ उपचारित BY-2 कोशिकाओं की ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच की गई। n=3. स्केल बार = 100 µm.
नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज और अनुप्रयोग ने मानव जीवन के विभिन्न पहलुओं, जिसमें चिकित्सा और कृषि शामिल है, में महत्वपूर्ण प्रगति की है। प्राकृतिक संसाधनों से उपयोगी यौगिक प्राप्त करने के लिए ऐतिहासिक शोध किए गए हैं। विशेष रूप से, एक्टिनोमाइसेट्स को नेमाटोड के लिए एंटीपैरासिटिक एंटीबायोटिक के रूप में उपयोगी माना जाता है, क्योंकि वे एवरमेक्टिन, आइवरमेक्टिन और ब्लीओमाइसिन और इसके डेरिवेटिव के प्रमुख यौगिक जैसे विभिन्न द्वितीयक मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करने की अपनी क्षमता के कारण, एक एंटीकैंसर एजेंट के रूप में औषधीय रूप से उपयोग किए जाते हैं21,22। इसी तरह, एक्टिनोमाइसेट्स से कई प्रकार के शाकनाशी यौगिकों की खोज की गई है, जिनमें से कुछ का पहले से ही व्यावसायिक रूप से उपयोग किया जा रहा है1,23। इसलिए, वांछित जैविक गतिविधियों वाले प्राकृतिक उत्पादों को अलग करने के लिए एक्टिनोमाइसेट्स मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण एक प्रभावी रणनीति माना जाता है। इस अध्ययन में, हमने एस. वेरेंसिस से एक नया यौगिक, कौमामोनामाइड की खोज की और इसे सफलतापूर्वक संश्लेषित किया। उर्सोनिक एसिड अर्बेनामाइड और इसके डेरिवेटिव का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती है। यह विशिष्ट जड़ कर्लिंग का कारण बन सकता है, मध्यम से मजबूत शाकनाशी गतिविधि प्रदर्शित कर सकता है, और सीधे या परोक्ष रूप से पौधे के सूक्ष्मनलिका को नुकसान पहुंचा सकता है। हालांकि, उर्मोटोनिक एसिड की क्रिया का तंत्र मौजूदा सूक्ष्मनलिका अवरोधकों से भिन्न हो सकता है, क्योंकि KAND 11 एक्टिन फिलामेंट्स को भी बाधित करता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, जो एक विनियामक तंत्र का सुझाव देता है जिसके द्वारा उर्मोटोनिक एसिड और इसके व्युत्पन्न साइटोस्केलेटल संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करते हैं।
अर्बेनोनिक एसिड के आगे विस्तृत लक्षण वर्णन से अर्बेनोनिक एसिड की क्रियाविधि को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। विशेष रूप से, अगला लक्ष्य उर्सोनिक एसिड की कम हो चुकी सूक्ष्मनलिकाओं से जुड़ने की क्षमता का मूल्यांकन करना है, ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या उर्सोनिक एसिड और इसके व्युत्पन्न सीधे सूक्ष्मनलिकाओं पर कार्य करते हैं और उन्हें डीपोलीमराइज़ करते हैं, या क्या उनकी क्रिया के परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिका अस्थिर होती है। इसके अलावा, ऐसे मामले में जहां सूक्ष्मनलिकाएं प्रत्यक्ष लक्ष्य नहीं हैं, पौधों की कोशिकाओं पर उर्सोनिक एसिड की क्रिया स्थल और आणविक लक्ष्यों की पहचान करने से संबंधित यौगिकों के गुणों और शाकनाशी गतिविधि को बेहतर बनाने के संभावित तरीकों को समझने में मदद मिलेगी। हमारे जैवसक्रियता परख ने पौधों जैसे कि अरेबिडोप्सिस थालियाना, तंबाकू और लिवरवॉर्ट की वृद्धि पर उर्सोनिक एसिड की अद्वितीय साइटोटॉक्सिक क्षमता का खुलासा किया, जबकि न तो ई. कोली और न ही हेला कोशिकाएं प्रभावित हुईं। जानवरों की कोशिकाओं के लिए बहुत कम या कोई विषाक्तता नहीं होना उर्सोनिक एसिड व्युत्पन्नों का एक लाभ है यदि उन्हें खुले कृषि क्षेत्रों में उपयोग के लिए शाकनाशी के रूप में विकसित किया जाता है। दरअसल, चूंकि यूकेरियोट्स में माइक्रोट्यूब्यूल सामान्य संरचनाएं हैं, इसलिए पौधों में उनका चयनात्मक अवरोधन शाकनाशियों के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, प्रोपीज़ामाइड, एक माइक्रोट्यूब्यूल डीपोलीमराइज़िंग एजेंट जो सीधे ट्यूबुलिन से जुड़ता है और पोलीमराइज़ेशन को रोकता है, इसका उपयोग पशु कोशिकाओं के लिए इसकी कम विषाक्तता के कारण शाकनाशी के रूप में किया जाता है24। डिसोपाइरामाइड के विपरीत, संबंधित बेंजामाइड्स में अलग-अलग लक्ष्य विशिष्टताएँ होती हैं। पौधों की सूक्ष्मनलिकाओं के अलावा, RH-4032 या बेंजोक्सामाइड भी क्रमशः पशु कोशिकाओं या ऊमाइसीट्स की सूक्ष्मनलिकाओं को रोकता है, और ज़ालिलामाइड का उपयोग इसकी कम फाइटोटॉक्सिसिटी के कारण कवकनाशी के रूप में किया जाता है25,26,27। नए खोजे गए भालू और इसके व्युत्पन्न पौधों के खिलाफ चयनात्मक साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य है कि आगे के संशोधन उनकी लक्ष्य विशिष्टता को बदल सकते हैं, संभावित रूप से रोगजनक कवक या ऊमाइसीट्स के नियंत्रण के लिए अतिरिक्त व्युत्पन्न प्रदान कर सकते हैं।
अर्बेनोनिक एसिड और इसके व्युत्पन्नों के अनूठे गुण उनके शाकनाशी के रूप में विकास और अनुसंधान उपकरण के रूप में उपयोग के लिए उपयोगी हैं। पौधे की कोशिका के आकार को नियंत्रित करने में साइटोस्केलेटन के महत्व को व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है। पहले के अध्ययनों से पता चला है कि पौधों ने रूप-रचना को ठीक से नियंत्रित करने के लिए सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करके कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के जटिल तंत्र विकसित किए हैं। सूक्ष्मनलिका गतिविधि के नियमन के लिए जिम्मेदार बड़ी संख्या में अणुओं की पहचान की गई है, और संबंधित शोध अभी भी जारी है3,4,28। पौधों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के बारे में हमारी वर्तमान समझ कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के तंत्र को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं करती है। उदाहरण के लिए, हालाँकि डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन दोनों ही सूक्ष्मनलिका को डीपोलीमराइज़ कर सकते हैं, डिसोपाइरामाइड गंभीर जड़ विकृति का कारण बनता है जबकि ओरिज़ालिन का अपेक्षाकृत हल्का प्रभाव होता है। इसके अलावा, ट्यूबुलिन में उत्परिवर्तन, जो सूक्ष्मनलिका को स्थिर करता है, जड़ों में डेक्सट्रोटेशन का भी कारण बनता है, जबकि पैक्लिटैक्सेल, जो सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को भी स्थिर करता है, ऐसा नहीं करता है। इसलिए, उर्सोलिक एसिड के आणविक लक्ष्यों का अध्ययन और पहचान करने से पौधों के कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल के विनियमन में नई जानकारी मिलनी चाहिए। इसी तरह, विकृत वृद्धि को बढ़ावा देने वाले रसायनों, जैसे कि डिसोपाइरामाइड, और कम प्रभावी रसायनों, जैसे कि ओरिज़ालिन या कुमामोटरिक एसिड की भविष्य की तुलना से पता चलेगा कि विकृत वृद्धि कैसे होती है।
दूसरी ओर, रक्षा-संबंधी साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था, उर्सोनिक एसिड की साइटोटॉक्सिसिटी को समझाने की एक और संभावना है। किसी रोगजनक का संक्रमण या पौधों की कोशिकाओं में एलिसिटर का प्रवेश कभी-कभी साइटोस्केलेटन के विनाश और उसके बाद कोशिका मृत्यु का कारण बनता है29। उदाहरण के लिए, ऊमाइसीट-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सैंथिन को तंबाकू कोशिका मृत्यु से पहले माइक्रोट्यूब्यूल और एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित करने की सूचना मिली है, जो KAND उपचार30,31 के साथ होता है। उर्सोनिक एसिड द्वारा प्रेरित रक्षा प्रतिक्रियाओं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बीच समानता ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि वे सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं, हालांकि क्रिप्टोक्सैंथिन की तुलना में उर्सोनिक एसिड का तेज़ और मजबूत प्रभाव स्पष्ट है। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि एक्टिन फिलामेंट्स का विघटन स्वतःस्फूर्त कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है, जो हमेशा माइक्रोट्यूब्यूल विघटन29 के साथ नहीं होता है। इसके अलावा, यह देखा जाना बाकी है कि क्या रोगजनक या एलिसिटर विकृत जड़ वृद्धि का कारण बनता है, जैसा कि उर्सोनिक एसिड डेरिवेटिव करते हैं। इस प्रकार, रक्षा प्रतिक्रियाओं और साइटोस्केलेटन को जोड़ने वाला आणविक ज्ञान एक आकर्षक समस्या है जिस पर ध्यान दिया जाना चाहिए। यूरसोनिक एसिड से संबंधित कम आणविक भार यौगिकों की उपस्थिति का फायदा उठाकर, साथ ही अलग-अलग शक्तियों वाले व्युत्पन्नों की एक श्रृंखला का उपयोग करके, वे अज्ञात सेलुलर तंत्रों को लक्षित करने के अवसर प्रदान कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले नए यौगिकों की खोज और अनुप्रयोग, पौधे की कोशिका के आकार निर्धारण में अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्र को संबोधित करने के लिए शक्तिशाली तरीके प्रदान करेंगे। इस संदर्भ में, हाल ही में विकसित यौगिक उर्मोटोनिक एसिड, जो सूक्ष्मनलिका और एक्टिन तंतुओं को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है, सूक्ष्मनलिका नियंत्रण और इन अन्य तंत्रों के बीच संबंध को समझने का अवसर प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, अर्बेनोनिक एसिड का उपयोग करके रासायनिक और जैविक विश्लेषण हमें आणविक विनियामक तंत्र को समझने में मदद करेगा जो पौधे के साइटोस्केलेटन को नियंत्रित करते हैं।
एस. वेरेंसिस MK493-CF1 को 500 mL के बफ़ल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्क में डालें जिसमें 110 mL बीज माध्यम है जिसमें 2% (w/v) गैलेक्टोज, 2% (w/v) एसेंस पेस्ट, 1% (w/v) बैक्टो संरचना है। -सोयटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.), 0.5% (w/v) मकई का अर्क (कोगोस्टच कंपनी, लिमिटेड, जापान), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 और 0.2% CaCO3 विआयनीकृत पानी में। (नसबंदी से पहले pH 7.4)। बीज संस्कृतियों को 27 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए एक रोटरी शेकर (180 आरपीएम) पर इनक्यूबेट किया गया था। ठोस अवस्था किण्वन के माध्यम से उत्पादन खेती। बीज संवर्धन (7 मिली) को 500 मिली K-1 फ्लास्क में स्थानांतरित किया गया जिसमें 40 ग्राम उत्पादन माध्यम था जिसमें 15 ग्राम दबाया हुआ जौ (MUSO Co., Ltd., जापान) और 25 ग्राम विआयनीकृत जल (नसबंदी से पहले pH समायोजित नहीं किया गया) था। 14 दिनों के लिए अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर किण्वन किया गया। किण्वन सामग्री को 40 मिली/बोतल EtOH के साथ निकाला गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (1500 ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (60 मिली) 10% MeOH/EtOAc के मिश्रण के साथ निकाला गया था। अवशेष (59.5 मिलीग्राम) प्राप्त करने के लिए कार्बनिक परत को कम दबाव में वाष्पित किया गया था, जिसे एक रिवर्स फेज कॉलम (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 माइक्रोन, ID 10 मिमी × लंबाई 250 मिमी) H2O/CH3CN पर ग्रेडिएंट निक्षालन (0-10 मिनट: 90%) के साथ HPLC के अधीन किया गया था, 10-35 मिनट: 90% H2O/CH3CN से 70% H2O/CH3CN (ग्रेडिएंट), 35-45 मिनट: 90% H2O/EtOH, 45-155 मिनट: 90% H2O/EtOH से 100% EtOH (ग्रेडिएंट (ग्रेडिएंट), 155-200 मिनट: 100% EtOH) 1.5 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर,
कुमामोटोमाइड(1); 1H-एनएमआर (500 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 6.93 (टी, जे = 2.5 हर्ट्ज, 1एच), 6.76 (डीडी, जे = 4.3, 1.8 हर्ट्ज 1एच), 6.05 (टी, जे = 3.8 हर्ट्ज, 1एच)। ), 4.08 (एस, 3एच); 13सी-एनएमआर (125 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ईएसआई-एचआरएमएस [एम+एच]+: [सी6एच9एन2ओ2]+ गणना मूल्य: 141.0659, मापा मूल्य: 141.0663, आईआर νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 सेमी–1।
कोलंबिया के बीज (Col-0) को शोध उपयोग की अनुमति के साथ अरेबिडोप्सिस जैविक संसाधन केंद्र (ABRC) से प्राप्त किया गया था। Col-0 के बीजों को हमारी प्रयोगशाला स्थितियों के तहत प्रचारित और बनाए रखा गया और जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस पौधों के रूप में इस्तेमाल किया गया। अरेबिडोप्सिस के बीजों को सतह पर निष्फल किया गया और 2% सुक्रोज (फ़ूजीफ़िल्म वाको प्योर केमिकल), 0.05% (w/v) 2-(4-मॉर्फोलिनो) इथेनसल्फ़ोनिक एसिड (MES) (फ़ूजीफ़िल्म वाको प्योर केमिकल) और 1.5% अगर (फ़ूजीफ़िल्म वाको प्योर केमिकल), pH 5.7, 23 °C और निरंतर प्रकाश युक्त आधी ताकत वाले मुराशिगे और स्कोग माध्यम में संवर्धित किया गया। phs1-1 उत्परिवर्ती के बीज टी. हाशिमोटो (नारा इंस्टीट्यूट ऑफ़ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) द्वारा प्रदान किए गए थे।
एसआर-1 स्ट्रेन के बीज टी. हाशिमोटो (नारा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) द्वारा प्रदान किए गए थे और जंगली प्रकार के तम्बाकू पौधों के रूप में इस्तेमाल किए गए थे। तम्बाकू के बीजों को सतह पर जीवाणुरहित किया गया और अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए तीन रातों तक बाँझ पानी में भिगोया गया, फिर उन्हें 2% सुक्रोज, 0.05% (w/v) एमईएस, और 0.8% जेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) मुराशिगे और स्कोग मीडियम) युक्त आधे-शक्ति वाले घोल में रखा गया, जिसका पीएच 5.7 था और लगातार रोशनी में 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया।
स्ट्रेन टैक-1 टी. कोची (क्योटो यूनिवर्सिटी) द्वारा प्रदान किया गया था और लिवरवॉर्ट अध्ययन के लिए मानक प्रयोगात्मक इकाई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जेम्मा को निष्फल सुसंस्कृत पौधों से प्राप्त किया गया और फिर 1% सुक्रोज और 0.3% जेलन गम युक्त गैम्बोर्ग बी5 माध्यम (फ़ूजीफ़िल्म वाको प्योर केमिकल) पर चढ़ाया गया और निरंतर प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया।
तम्बाकू BY-2 कोशिकाएँ (निकोटियाना टैबैकम एल. सी.वी. ब्राइट येलो 2) एस. हसेजावा (टोक्यो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई थीं। BY-2 कोशिकाओं को संशोधित लिंसमीयर और स्कोग माध्यम में 95 गुना पतला किया गया और साप्ताहिक रूप से 2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसिटिक एसिड 32 के साथ पूरक किया गया। सेल निलंबन को अंधेरे में 27 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर एक रोटरी शेकर पर मिलाया गया था। कोशिकाओं को ताजा माध्यम की मात्रा से 10 गुना मात्रा में धोएँ और उसी माध्यम में फिर से निलंबित करें। फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर के तहत माइक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 या एक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 को स्थिर रूप से व्यक्त करने वाली BY-2 ट्रांसजेनिक सेल लाइनें वर्णित 33,34,35 के अनुसार उत्पन्न की गईं। इन सेल लाइनों को मूल BY-2 सेल लाइन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का उपयोग करके बनाए रखा और सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है।
हेला कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37°C इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलिन और 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में संवर्धित किया गया।
इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग जापानी जैव सुरक्षा नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
यौगिकों को डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO; फ़ूजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) में स्टॉक घोल के रूप में घोला गया और अरेबिडोप्सिस के लिए MS माध्यम और लिवरवॉर्ट के लिए तंबाकू या गैम्बर्ग B5 माध्यम में पतला किया गया। जड़ वृद्धि अवरोध परख के लिए, प्रति प्लेट 10 से अधिक बीजों को संकेतित यौगिकों या DMSO युक्त अगर माध्यम पर बोया गया। बीजों को 7 दिनों के लिए विकास कक्ष में रखा गया। अंकुरों की तस्वीरें ली गईं और जड़ों की लंबाई मापी गई। अरेबिडोप्सिस अंकुरण परख के लिए, प्रति प्लेट 48 बीजों को 200 ¼M यौगिक या DMSO युक्त अगर माध्यम पर बोया गया। अरेबिडोप्सिस के बीजों को विकास कक्ष में उगाया गया और अंकुरित अंकुरों की संख्या अंकुरण के 7 दिन बाद गिनी गई (dag)। तंबाकू अंकुरण परख के लिए, लिवरवॉर्ट वृद्धि अवरोधन परख के लिए, प्रत्येक प्लेट से 9 भ्रूणों को KAND या DMSO की संकेतित सांद्रता वाले अगर माध्यम पर रखा गया और 14 दिनों के लिए वृद्धि कक्ष में रखा गया।
रूट मेरिस्टेम संगठन को देखने के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) से रंगे हुए पौधों का उपयोग करें। पीआई संकेतों को टीसीएस एसपीई कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया।
मालामी और बेनफी द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार β-ग्लुकुरोनिडेस (GUS) के साथ जड़ों का हिस्टोकेमिकल धुंधलापन किया गया36. अंकुरों को रात भर 90% एसीटोन में स्थिर किया गया, 1 घंटे के लिए GUS बफर में 0.5 mg/ml 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-d-ग्लुकुरोनिक एसिड के साथ दाग दिया गया और हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड घोल में रखा गया। (8 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 2 मिली पानी और 1 मिली ग्लिसरॉल) और एक एक्सियो इमेजर M1 माइक्रोस्कोप (कार्ल ज़ीस) का उपयोग करके अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया।
ऊर्ध्वाधर रूप से रखी गई प्लेटों पर उगाए गए 7-दिन पुराने पौधों पर जड़ के कोण मापे गए। चरण 6 में बताए अनुसार गुरुत्वाकर्षण वेक्टर की दिशा से जड़ के कोण को मापें।
कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स की व्यवस्था को प्रोटोकॉल 37 में मामूली संशोधनों के साथ वर्णित अनुसार देखा गया। एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) और एलेक्सा फ्लुओर 488-संयुग्मित एंटी-माउस IgG (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A32723) को क्रमशः 1:1000 और 1:100 कमजोर पड़ने पर प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया। फ्लोरोसेंस इमेज को TCS SPE कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) का उपयोग करके प्राप्त किया गया। Z-स्टैक इमेज प्राप्त करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अधिकतम तीव्रता वाले प्रोजेक्शन बनाएं।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके हेला कोशिका प्रसार परख किया गया।
ई. कोलाई डीएच5α की वृद्धि का विश्लेषण 600 एनएम (ओडी600) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संवर्धन में कोशिका घनत्व को मापकर किया गया।
ट्रांसजेनिक BY-2 कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल संगठन को CSU-X1 कॉन्फोकल स्कैनिंग डिवाइस (योकोगावा) और एक sCMOS कैमरा (ज़ाइला, एंडर टेक्नोलॉजी) से सुसज्जित फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया। छवि विश्लेषण द्वारा साइटोस्केलेटल घनत्व का आकलन किया गया, जिसने इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों में साइटोप्लाज़मिक पिक्सल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सल के प्रतिशत को निर्धारित किया, जैसा कि वर्णित है38,39।
BY-2 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए, सेल सस्पेंशन के एक अंश को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.05% इवांस ब्लू के साथ संवर्धित किया गया। मृत कोशिकाओं का चयनात्मक इवांस ब्लू धुंधलापन, जीवित कोशिकाओं से बरकरार प्लाज्मा झिल्ली40 द्वारा डाई के निष्कासन पर निर्भर करता है। ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोप (BX53, ओलंपस) का उपयोग करके दागी गई कोशिकाओं का निरीक्षण किया गया।
हेला कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 10% FBS के साथ पूरक DMEM में उगाया गया। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए 100 μM KAND 11, कुमामोनमिक एसिड 6, कुमामोनमाइड 1, 100 ng/ml कोलसेमिड (गिब्को), या 100 ng/ml नोकोडमेज़ (सिग्मा) के साथ उपचारित किया गया। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए MetOH के साथ और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एसीटेट के साथ स्थिर किया गया। स्थिर कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 0.5% BSA/PBS में पतला करके β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी (1D4A4, प्रोटीनटेक: 66240-1) के साथ इनक्यूबेट किया गया, TBST से 3 बार धोया गया, और फिर एलेक्सा फ्लुओर बकरी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। 488 1 घंटा। – माउस आईजीजी (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A11001) और 15 एनजी/एमएल 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) को 0.5% बीएसए/पीबीएस में पतला किया गया। टीबीएसटी से तीन बार धोने के बाद, निकॉन एक्लिप्स टीआई-ई उल्टे माइक्रोस्कोप पर दागदार कोशिकाओं को देखा गया। मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर (मॉलिक्यूलर डिवाइस) का उपयोग करके कूल्ड हमामात्सु ओआरसीए-आर2 सीसीडी कैमरे से छवियों को कैप्चर किया गया।