पौधों की सूक्ष्मनलिकाओं को प्रभावित करने वाले नए पौध वृद्धि अवरोधकों के रूप में उर्सा मोनोएमाइड्स की खोज, लक्षण वर्णन और कार्यात्मक सुधार।

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प्राकृतिक उत्पादों की खोज और लाभकारी उपयोग मानव जीवन को बेहतर बनाने में सहायक हो सकते हैं। पादप वृद्धि अवरोधक रसायनों का व्यापक रूप से खरपतवार नियंत्रण हेतु शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है। विभिन्न प्रकार के शाकनाशियों के उपयोग की आवश्यकता के कारण, क्रिया के नए तंत्रों वाले यौगिकों की पहचान करना आवश्यक है। इस अध्ययन में, हमने स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेंसिस MK493-CF1 से एक नवीन N-एल्कॉक्सीपाइरोल यौगिक, कौमामोनामाइड, की खोज की और संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित की। जैविक क्रियाशीलता परख के माध्यम से, हमने पाया कि urs-मोनोएमिक अम्ल, urs-मोनोएमाइड का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती है और एक संभावितपौधों की वृद्धि अवरोधकइसके अलावा, हमने विभिन्न अर्बेनोनिक अम्ल व्युत्पन्न विकसित किए हैं, जिनमें अर्बेनिलॉक्सी व्युत्पन्न (UDA) भी शामिल है, जिसमें हेला कोशिकाओं की वृद्धि को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना उच्च शाकनाशी क्रियाशीलता होती है। हमने यह भी पाया कि अर्मोनोनिक अम्ल व्युत्पन्न पौधों की सूक्ष्मनलिकाओं को नष्ट करते हैं; इसके अलावा, KAND एक्टिन तंतुओं को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है; ये बहुआयामी प्रभाव ज्ञात सूक्ष्मनलिका अवरोधकों से भिन्न हैं और अर्सोनिक अम्ल की क्रियाविधि का एक नया संकेत देते हैं, जो नए शाकनाशियों के विकास में एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।
लाभकारी प्राकृतिक उत्पादों और उनके व्युत्पन्नों की खोज और व्यावहारिक अनुप्रयोग मानव जीवन की गुणवत्ता में सुधार का एक साधन है। सूक्ष्मजीवों, पौधों और कीटों द्वारा उत्पादित द्वितीयक उपापचयजों ने चिकित्सा और कृषि में महत्वपूर्ण प्रगति की है। प्राकृतिक उत्पादों से कई एंटीबायोटिक्स और ल्यूकेमिया-रोधी दवाएँ विकसित की गई हैं। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार केकीटनाशककृषि में उपयोग के लिए इन प्राकृतिक उत्पादों से कवकनाशी और शाकनाशी निकाले जाते हैं। विशेष रूप से, खरपतवार नियंत्रण शाकनाशी आधुनिक कृषि में फसल की पैदावार बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं, और विभिन्न प्रकार के यौगिकों का व्यावसायिक रूप से पहले से ही उपयोग किया जा रहा है। पौधों में कई कोशिकीय प्रक्रियाएँ, जैसे प्रकाश संश्लेषण, अमीनो अम्ल उपापचय, कोशिका भित्ति संश्लेषण, समसूत्री विभाजन का नियमन, फाइटोहॉर्मोन संकेतन, या प्रोटीन संश्लेषण, शाकनाशियों के विशिष्ट लक्ष्य माने जाते हैं। सूक्ष्मनलिका के कार्य को बाधित करने वाले यौगिक शाकनाशियों का एक सामान्य वर्ग हैं जो समसूत्री नियमन को प्रभावित करके पौधों की वृद्धि को प्रभावित करते हैं।
सूक्ष्मनलिकाएँ कोशिका कंकाल के घटक हैं और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से संरक्षित हैं। ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर में α-ट्यूबुलिन और β-ट्यूबुलिन होते हैं जो रैखिक सूक्ष्मनलिका प्रोटोफिलामेंट बनाते हैं, जिसमें 13 प्रोटोफिलामेंट एक बेलनाकार संरचना बनाते हैं। सूक्ष्मनलिकाएँ पादप कोशिकाओं में कई भूमिकाएँ निभाती हैं, जिनमें कोशिका आकार, कोशिका विभाजन और अंतःकोशिकीय परिवहन3,4 का निर्धारण शामिल है। पादप कोशिकाओं में अंतरावस्था प्लाज्मा झिल्ली के नीचे सूक्ष्मनलिकाएँ होती हैं, और माना जाता है कि ये तथाकथित कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएँ सेल्यूलोज सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स4,5 के नियमन के माध्यम से सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतुओं के संगठन को नियंत्रित करती हैं। जड़ की एपिडर्मल कोशिकाओं के कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएँ, जो जड़ के सिरे के तीव्र विस्तार वाले क्षेत्र में स्थित होती हैं, पार्श्व में स्थित होती हैं, और सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु इन सूक्ष्मनलिकाओं का अनुसरण करते हैं और कोशिका विस्तार की दिशा को सीमित करते हैं, जिससे अनिसोट्रोपिक कोशिका विस्तार को बढ़ावा मिलता है। इसलिए, सूक्ष्मनलिका का कार्य पादप आकारिकी से निकटता से संबंधित है। ट्यूबुलिन को कूटबद्ध करने वाले जीन में अमीनो अम्ल प्रतिस्थापन के कारण कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका समूह में विषमता आती है और अरेबिडोप्सिस 6,7 में बायीं या दायीं ओर वृद्धि होती है। इसी प्रकार, सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले सूक्ष्मनलिका-संबंधी प्रोटीन में उत्परिवर्तन भी विकृत जड़ वृद्धि8,9,10,11,12,13 का कारण बन सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका-विघटनकारी शाकनाशियों, जैसे कि डिसोपाइरामाइड, जिसे प्रीटिलाक्लोर भी कहते हैं, से उपचार भी बायीं ओर तिरछी जड़ वृद्धि14 का कारण बनता है। ये आँकड़े दर्शाते हैं कि पौधों की वृद्धि की दिशा निर्धारित करने के लिए सूक्ष्मनलिका कार्य का सटीक नियमन महत्वपूर्ण है।
विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मनलिका अवरोधकों की खोज की गई है, और इन दवाओं ने कोशिका-कंकाल अनुसंधान के साथ-साथ कृषि और चिकित्सा में भी महत्वपूर्ण योगदान दिया है।2 विशेष रूप से, ओरिज़ेलिन, डाइनाइट्रोएनिलिन यौगिक, डिसोपाइरामाइड, बेंजामाइड-संबंधित यौगिक, और उनके अनुरूप सूक्ष्मनलिका के कार्य को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार पादप वृद्धि को बाधित कर सकते हैं। इसलिए, इनका व्यापक रूप से शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है। हालाँकि, चूँकि सूक्ष्मनलिकाएँ पादप और जंतु कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घटक हैं, इसलिए अधिकांश सूक्ष्मनलिका अवरोधक दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए कोशिकाविषैले होते हैं। इसलिए, शाकनाशी के रूप में उनकी मान्यता प्राप्त उपयोगिता के बावजूद, व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए सीमित संख्या में सूक्ष्मनलिका विरोधी एजेंटों का उपयोग किया जाता है।
स्ट्रेप्टोमाइसेस स्ट्रेप्टोमाइसेस परिवार का एक जीनस है, जिसमें एरोबिक, ग्राम पॉजिटिव, फिलामेंटस बैक्टीरिया शामिल हैं और व्यापक रूप से द्वितीयक मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्पादन करने की क्षमता के लिए जाना जाता है। इसलिए, इसे नए जैविक रूप से सक्रिय प्राकृतिक उत्पादों के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक माना जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने कौमामोनामाइड नामक एक नए यौगिक की खोज की, जिसे स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेंसिस एमके493-सीएफ1 और एस वेरेंसिस आईएसपी 5486 से अलग किया गया था। स्पेक्ट्रल विश्लेषण और पूर्ण स्पेक्ट्रल विश्लेषण का उपयोग करके, कौमामोनामाइड की संरचना की विशेषता थी और इसके अद्वितीय एन-एल्कॉक्सीपाइरोल कंकाल को निर्धारित किया गया था। संश्लेषण। उर्समोनोएमाइड और इसके व्युत्पन्नों का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती, उर्समोनिक एसिड, लोकप्रिय मॉडल पौधे अरेबिडोप्सिस थालियाना के विकास और अंकुरण को बाधित करने वाला पाया गया। संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन में, हमने पाया कि C9 युक्त एक यौगिक जिसे उर्सोनिक अम्ल में रूपांतरित किया गया है, जिसे उर्सोनिक अम्ल का नॉनाइलॉक्सी व्युत्पन्न (KAND) कहा जाता है, वृद्धि और अंकुरण पर निरोधात्मक प्रभाव को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है। उल्लेखनीय रूप से, नव खोजे गए पादप वृद्धि अवरोधक ने तंबाकू और लिवरवॉर्ट की वृद्धि को भी प्रभावित किया और यह बैक्टीरिया या हेला कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक नहीं था। इसके अलावा, कुछ उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्न विकृत जड़ फेनोटाइप को प्रेरित करते हैं, जिसका अर्थ है कि ये व्युत्पन्न प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित करते हैं। इस विचार के अनुरूप, इम्यूनोहिस्टोकेमिकली या फ्लोरोसेंट प्रोटीन से लेबल किए गए सूक्ष्मनलिकाओं के हमारे अवलोकन यह संकेत देते हैं कि KAND उपचार सूक्ष्मनलिकाएं को डीपॉलीमराइज़ करता है।
टोक्यो के शिनागावा-कु में मिट्टी से MK493-CF1 स्ट्रेन को अलग किया गया। स्ट्रेन MK493-CF1 ने सुशाखित स्ट्रोमल माइसीलियम का निर्माण किया। 16S राइबोसोमल आरएनए जीन (1422 bp) का आंशिक अनुक्रम निर्धारित किया गया। यह स्ट्रेन S. वेरेंसिस (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: विशिष्ट स्ट्रेन, 99.93%) से काफी मिलता-जुलता है। इस परिणाम के आधार पर, यह निर्धारित किया गया कि यह स्ट्रेन S. वेरेंसिस के प्रकार के स्ट्रेन से निकटता से संबंधित था। इसलिए, हमने इस स्ट्रेन को अस्थायी रूप से S. वेरेंसिस MK493-CF1 नाम दिया। S. वेरेंसिस ISP 5486T भी वही जैवसक्रिय यौगिक उत्पन्न करता है। चूँकि इस सूक्ष्मजीव से प्राकृतिक उत्पाद प्राप्त करने के संबंध में प्रारंभिक शोध बहुत कम था, इसलिए आगे रासायनिक शोध किया गया। जौ के माध्यम पर एस. वेरेंसिस MK493-CF1 की खेती 30°C पर 14 दिनों तक ठोस अवस्था किण्वन द्वारा करने के बाद, माध्यम से 50% EtOH निकाला गया। 60 मिलीलीटर नमूने को सुखाकर 59.5 मिलीग्राम अपरिष्कृत अर्क प्राप्त किया गया। अपरिष्कृत अर्क को रिवर्स फेज HPLC में डालकर N-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड (1, जिसका नाम कौमामोनामाइड है, 36.0 मिलीग्राम) प्राप्त किया गया। 1 की कुल मात्रा अपरिष्कृत अर्क का लगभग 60% है। इसलिए, हमने कुमामोटोएमाइड 1 के गुणों का विस्तार से अध्ययन करने का निर्णय लिया।
कौमामोनामाइड 1 एक सफेद अनाकार चूर्ण है और उच्च विभेदन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 (चित्र 1) की पुष्टि करती है। इस यौगिक के C2-प्रतिस्थापित पाइरोल खंड की विशेषता δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H NMR स्पेक्ट्रम में 1H, d, J = 2.5, δH: 4.5 Hz, H-5) और δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) है, और 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन परमाणुओं की उपस्थिति दर्शाता है। C2 स्थिति पर एक एमाइड समूह की उपस्थिति का आकलन C-3 प्रोटॉन से δC 161.1 पर एमाइड कार्बोनिल कार्बन तक HMBC सहसंबंध द्वारा किया गया था। इसके अलावा, δH 4.10 (3H, S) और δC 68.3 पर 1H और 13C NMR शिखर अणु में N-मेथॉक्सी समूहों की उपस्थिति का संकेत देते हैं। हालाँकि मेथॉक्सी समूह की सही स्थिति अभी तक स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण, जैसे कि उन्नत अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी और न्यूक्लियर ओवरहॉसर संक्षिप्तीकरण (NOEDF) का उपयोग करके निर्धारित नहीं की गई थी, N-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड पहला संभावित यौगिक बन गया।
1 की सही संरचना निर्धारित करने के लिए, कुल संश्लेषण किया गया था (चित्र 2 ए)। एम-सीपीबीए के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-एमिनोपाइरीडीन 2 के उपचार के परिणामस्वरूप मात्रात्मक उपज में संबंधित एन-ऑक्साइड 3 प्राप्त हुआ। 2 के 2-एमिनोएज़िडेशन के बाद, अब्रामोविच द्वारा वर्णित साइक्लोकंडेंसेशन प्रतिक्रिया को वांछित 1-हाइड्रॉक्सी-1 एच-पाइरोल-2-कार्बोनाइट्राइल 5 ग्राम में प्राप्त करने के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर बेंजीन में किया गया था। गति 60% (दो चरण)। 15,16। 4 के मिथाइलेशन और हाइड्रोलिसिस ने फिर 1-मेथॉक्सी-1 एच-पाइरोल-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (जिसे "क्यूमोटोनिक एसिड" कहा जाता है, 6) अच्छी उपज (70%, दो चरण) में दिया। अंत में, संश्लेषित 1 के सभी वर्णक्रमीय डेटा पृथक 1 के समान थे, इसलिए 1 की संरचना निर्धारित की गई;
अर्बेनामाइड और अर्बेनिक अम्ल की जैविक गतिविधि का सामान्य संश्लेषण और विश्लेषण। (क) कुमामोटो एमाइड का कुल संश्लेषण। (ख) सात दिन पुराने जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस कोलंबिया (कोल) के पौधों को मुराशिगे और स्कोग (एमएस) प्लेटों पर उगाया गया, जिनमें संकेतित सांद्रता पर कौमामोनामाइड 6 या कौमामोनामाइड 1 था। स्केल बार = 1 सेमी।
सबसे पहले, हमने पौधों की वृद्धि को नियंत्रित करने की अर्बेनामाइड और उसके मध्यवर्ती पदार्थों की जैविक गतिविधियों का आकलन किया। हमने एमएस अगर माध्यम में अर्बेनामाइड 1 या अर्सेमोनिक एसिड 6 की विभिन्न सांद्रताएँ डालीं और इस माध्यम पर अरेबिडोप्सिस थालियाना के पौधों का संवर्धन किया। इन परीक्षणों से पता चला कि 6 की उच्च सांद्रता (500 μM) ने जड़ों की वृद्धि को बाधित किया (चित्र 2b)। इसके बाद, हमने 6 के N1 स्थान को प्रतिस्थापित करके विभिन्न व्युत्पन्न उत्पन्न किए और उन पर संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन किए (एनालॉग संश्लेषण प्रक्रिया सहायक सूचना (SI) में वर्णित है)। अरेबिडोप्सिस के पौधों को 50 μM अर्सेमोनिक एसिड व्युत्पन्न युक्त माध्यम पर उगाया गया और जड़ की लंबाई मापी गई, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 3a, b, और S1 में दिखाया गया है, कौमामो अम्लों में N1 स्थिति पर रैखिक एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (9, 10, 11, 12, और 13) या बड़ी एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (15, 16, और 17) की अलग-अलग लंबाई होती है। व्युत्पन्नों ने जड़ वृद्धि में महत्वपूर्ण अवरोधन दिखाया। इसके अलावा, हमने पाया कि 200 μM 10, 11, या 17 के प्रयोग ने अंकुरण को बाधित किया (चित्र 3c और S2)।
कुमामोटो एमाइड और संबंधित यौगिकों के संरचना-सक्रियता संबंध का अध्ययन। (क) एनालॉग्स की संरचना और संश्लेषण योजना। (ख) 50 μM कुमामोनामाइड व्युत्पन्नों के साथ या बिना MS माध्यम पर उगाए गए 7-दिन पुराने पौधों की जड़ की लंबाई का परिमाणीकरण। तारांकन चिह्न शम उपचार (t परीक्षण, p) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।< 0.05). n>18. आँकड़े माध्य ± SD के रूप में दर्शाए गए हैं। nt का अर्थ है "परीक्षण नहीं किया गया" क्योंकि 50% से अधिक बीज अंकुरित नहीं हुए। (c) 200 μM कौमामोनामाइड और संबंधित यौगिकों के साथ या बिना MS माध्यम में 7 दिनों तक इनक्यूबेट किए गए उपचारित बीजों की अंकुरण दर का परिमाणीकरण। तारांकन चिह्न शम उपचार (काई-स्क्वायर परीक्षण) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। n=96.
दिलचस्प बात यह है कि C9 से अधिक लम्बी एल्काइल साइड चेन के जुड़ने से निरोधात्मक गतिविधि कम हो गई, जिससे पता चलता है कि कुमामोटोइक एसिड से संबंधित यौगिकों को अपनी जैविक गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए एक निश्चित आकार की साइड चेन की आवश्यकता होती है।
चूँकि संरचना-सक्रियता संबंध विश्लेषण से पता चला कि C9 को उर्सोनिक अम्ल में परिवर्तित कर दिया गया था और उर्सोनिक अम्ल का नॉनाइलॉक्सी व्युत्पन्न (जिसे आगे KAND 11 कहा जाएगा) सबसे प्रभावी पादप वृद्धि अवरोधक था, इसलिए हमने KAND 11 का अधिक विस्तृत लक्षण-निर्धारण किया। 50 μM KAND 11 से अरेबिडोप्सिस के उपचार ने अंकुरण को लगभग पूरी तरह से रोक दिया, जबकि KAND 11 की कम सांद्रता (40, 30, 20, या 10 μM) ने खुराक-निर्भर तरीके से जड़ वृद्धि को बाधित किया (चित्र 4a, b)। यह जांचने के लिए कि क्या KAND 11 जड़ विभज्योतक व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, हमने प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) से अभिरंजित जड़ विभज्योतकों का परीक्षण किया और विभज्योतक क्षेत्र का आकार मापा। 25 μM KAND-11 युक्त माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 151.1 ± 32.5 μm था, जबकि DMSO युक्त नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 264.7 ± 30.8 μm था (चित्र 4c, d), जो दर्शाता है कि KAND-11 कोशिकीय गतिविधि को पुनर्स्थापित करता है। प्रसार। रूट मेरिस्टेम। इसके अनुरूप, KAND 11 उपचार ने रूट मेरिस्टेम (चित्र 4e) 17 में सेल डिवीजन मार्कर CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS सिग्नल की मात्रा को कम कर दिया। ये परिणाम दर्शाते हैं कि KAND 11 सेल प्रसार गतिविधि को कम करके रूट विकास को बाधित करता है।
अर्बेनोनिक अम्ल व्युत्पन्नों (अर्बेनिलॉक्सी व्युत्पन्नों) के विकास पर निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण। (क) 7 दिन पुराने जंगली प्रकार के कोल के पौधे, KAND 11 की संकेतित सांद्रता के साथ MS प्लेटों पर उगाए गए। स्केल बार = 1 सेमी। (ख) जड़ की लंबाई का परिमाणीकरण। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी एचएसडी परीक्षण, पृष्ठ< 0.05). n>16. आँकड़े माध्य ± SD के रूप में दर्शाए गए हैं। (c) 25 μM KAND के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाई गई प्रोपिडियम आयोडाइड-रंजित वाइल्ड-टाइप कोल जड़ों की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। 11. सफेद कोष्ठक मूल विभज्योतक को दर्शाते हैं। स्केल बार = 100 µm। (d) मूल विभज्योतक आकार का परिमाणीकरण (n = 10 से 11)। सांख्यिकीय अंतर t-परीक्षण (p) का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे।< 0.05)। पट्टियाँ औसत मेरिस्टेम आकार को दर्शाती हैं। (ई) सीडीकेबी2 संरचना वाले रूट मेरिस्टेम की विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी; 1pro: सीडीकेबी2; 1-जीयूएस अभिरंजित और 25 µM केएएनडी परख के साथ या उसके बिना एमएस प्लेटों पर उगाए गए 5-दिन पुराने पौधों पर अभिरंजित।
KAND 11 की फाइटोटॉक्सिसिटी का परीक्षण एक अन्य द्विबीजपत्री पौधे, तम्बाकू (निकोटियाना टैबैकम), और एक प्रमुख स्थलीय पादप मॉडल जीव, लिवरवॉर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमॉर्फा) का उपयोग करके किया गया। अरेबिडोप्सिस की तरह, 25 μM KAND 11 युक्त माध्यम पर उगाए गए तम्बाकू SR-1 के पौधों की जड़ें छोटी थीं (चित्र 5a)। इसके अतिरिक्त, 48 में से 40 बीज 200 μM KAND 11 युक्त प्लेटों पर अंकुरित हुए, जबकि सभी 48 बीज नकली उपचारित माध्यम पर अंकुरित हुए, जिससे संकेत मिलता है कि KAND की उच्च सांद्रता महत्वपूर्ण थी (p< 0.05; ची परीक्षण-वर्ग) ने तंबाकू के अंकुरण को बाधित किया। (चित्र 5 बी)। इसके अलावा, KAND 11 की सांद्रता जिसने लिवरवॉर्ट में बैक्टीरिया के विकास को बाधित किया, वह अरेबिडोप्सिस (चित्र 5 सी) में प्रभावी सांद्रता के समान थी। ये परिणाम संकेत देते हैं कि KAND 11 विभिन्न प्रकार के पौधों के विकास को बाधित कर सकता है। फिर हमने अन्य जीवों में भालू मोनोएमाइड-संबंधित यौगिकों की संभावित साइटोटोक्सिसिटी की जांच की, अर्थात् मानव हेला कोशिकाएं और एस्चेरिचिया कोली स्ट्रेन DH5α, क्रमशः उच्चतर पशु और बैक्टीरिया कोशिकाओं के प्रतिनिधियों के रूप में। सेल प्रसार परख की एक श्रृंखला में, हमने देखा कि कौमामोनामाइड 1, कौमामोनामिडिक एसिड 6 और KAND 11 ने 100 μM (चित्र 5 डी, ई) की सांद्रता पर हेला या ई कोली कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं किया।
गैर-अरबीडोप्सिस जीवों में KAND 11 का विकास अवरोध। (a) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार SR-1 तम्बाकू के पौधों को 25 μM KAND 11 युक्त लंबवत स्थित MS प्लेटों पर उगाया गया। (b) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार SR-1 तम्बाकू के पौधों को 200 μM KAND 11 युक्त क्षैतिज रूप से स्थित MS प्लेटों पर उगाया गया। (c) दो सप्ताह पुराने जंगली-प्रकार Tak-1 लिवरवॉर्ट कलियों को KAND 11 की संकेतित सांद्रता के साथ गैम्बोर्ग B5 प्लेटों पर उगाया गया। लाल तीर उन बीजाणुओं को दर्शाते हैं जिन्होंने दो सप्ताह की ऊष्मायन अवधि के भीतर बढ़ना बंद कर दिया। (d) हेला कोशिकाओं का कोशिका प्रसार परख। व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके निश्चित समय अंतराल पर मापा गया। विश्लेषण तीन प्रतियों में किए गए। (ई) ई. कोलाई कोशिका प्रसार परख। ई. कोलाई वृद्धि का विश्लेषण OD600 मापकर किया गया। नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को 50 μg/ml एम्पीसिलीन (Amp) से उपचारित किया गया, जो जीवाणु कोशिका भित्ति संश्लेषण को रोकता है। विश्लेषण तीन प्रतियों में किए गए।
यूरामाइड-संबंधित यौगिकों के कारण होने वाली साइटोटॉक्सिसिटी की क्रियाविधि को समझने के लिए, हमने मध्यम निरोधात्मक प्रभावों के साथ यूरामाइड एसिड डेरिवेटिव का पुनः विश्लेषण किया, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 2b, 6a में दिखाया गया है, यूरामाइड एसिड 6 की उच्च सांद्रता (200 μM) युक्त अगर प्लेटों पर उगाए गए पौधों ने छोटी और बाईं ओर मुड़ी हुई जड़ें (θ = – 23.7 ± 6.1) उत्पन्न कीं, जबकि नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों में, पौधों ने लगभग सीधी जड़ें (θ = – 3.8 ± 7.1) उत्पन्न कीं। यह विशिष्ट तिरछी वृद्धि कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स14,18 की शिथिलता के परिणामस्वरूप जानी जाती है। इस खोज के अनुरूप, माइक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करने वाली दवाएं डिसोपाइरामाइड और ओराइज़ेलिन ने हमारी वृद्धि की परिस्थितियों में समान जड़ झुकाव को प्रेरित किया (चित्र 2b, 6a)। उसी समय, हमने उर्मटोनिक एसिड व्युत्पन्नों का परीक्षण किया और उनमें से कई का चयन किया, जो निश्चित सांद्रता पर तिरछी जड़ वृद्धि को प्रेरित करते थे। यौगिक 8, 9 और 15 ने क्रमशः 75 μM, 50 μM और 40 μM पर जड़ वृद्धि की दिशा बदल दी, जो दर्शाता है कि ये यौगिक प्रभावी रूप से सूक्ष्मनलिकाएं को अस्थिर कर सकते हैं (चित्र 2b, 6a)। हमने सबसे शक्तिशाली उर्मोलिक एसिड व्युत्पन्न, KAND 11 का भी कम सांद्रता (15 µM) पर परीक्षण किया और पाया कि KAND 11 के अनुप्रयोग ने जड़ वृद्धि को बाधित किया और जड़ वृद्धि की दिशा असमान थी, हालाँकि वे बाईं ओर झुकी हुई थीं (चित्र C3)। 25 μM KAND 11 से उपचारित अंकुर जड़ों की एपिडर्मल कोशिकाओं में एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने दीर्घीकरण क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में लगभग सभी कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के लुप्त होने को दर्शाया (चित्र 6b)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि कुमामोटोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न माइक्रोट्यूब्यूल्स पर प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से कार्य करके उन्हें बाधित करते हैं और ये यौगिक नए माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधक हैं।
अर्सोनिक अम्ल और उसके व्युत्पन्न अरेबिडोप्सिस थालियाना में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं को परिवर्तित करते हैं। (a) विभिन्न उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्नों की उपस्थिति में संकेतित सांद्रता पर मूल झुकाव कोण मापा गया। सूक्ष्मनलिकाओं को बाधित करने वाले दो ज्ञात यौगिकों: डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन के प्रभावों का भी विश्लेषण किया गया। इनसेट में मूल वृद्धि कोण मापने के लिए प्रयुक्त मानक दर्शाया गया है। तारांकन चिह्न शम उपचार (t परीक्षण, p) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।< 0.05). n>19. स्केल बार = 1 सेमी. (b) दीर्घीकरण क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं। 25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाई गई वाइल्ड-टाइप अरेबिडोप्सिस कोल जड़ों में सूक्ष्मनलिकाएं β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी और एलेक्सा फ्लोरो-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिरंजन द्वारा देखी गईं। स्केल बार = 10 µm. (c) मूल विभज्योतक में सूक्ष्मनलिकाओं की समसूत्री संरचना। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिरंजन का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं देखी गईं। प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ़्रैग्मोप्लास्ट सहित समसूत्री संरचनाओं की गणना कॉन्फ़ोकल छवियों से की गई। तीर समसूत्री सूक्ष्मनलिका संरचनाओं को दर्शाते हैं। तारांकन चिह्न शम उपचार (t परीक्षण, p) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।< 0.05). n>9. स्केल बार = 50 µm.
यद्यपि उर्सा में सूक्ष्मनलिका के कार्य को बाधित करने की क्षमता है, फिर भी इसकी क्रियाविधि सामान्य सूक्ष्मनलिका विबहुलीकरण एजेंटों से भिन्न होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन जैसे सूक्ष्मनलिका विबहुलीकरण एजेंटों की उच्च सांद्रता, एपिडर्मल कोशिकाओं के अनिसोट्रोपिक विस्तार को प्रेरित करती है, जबकि KAND 11 ऐसा नहीं करता। इसके अतिरिक्त, KAND 11 और डिसोपाइरामाइड के सह-प्रयोग से डिसोपाइरामाइड-प्रेरित जड़ वृद्धि प्रतिक्रिया और KAND 11-प्रेरित वृद्धि अवरोधन देखा गया (चित्र S4)। हमने KAND 11 के प्रति अतिसंवेदनशील डिसोपाइरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्ती की प्रतिक्रिया का भी विश्लेषण किया। phs1-1 में एक गैर-विहित ट्यूबुलिन काइनेज बिंदु उत्परिवर्तन होता है और डिसोपाइरामाइड9,20 से उपचारित होने पर छोटी जड़ें उत्पन्न करता है। KAND 11 युक्त अगर माध्यम पर उगाए गए phs1-1 उत्परिवर्ती पौधों की जड़ें डिसोपाइरामिड पर उगाए गए पौधों के समान छोटी थीं (चित्र S5)।
इसके अलावा, हमने KAND 11 से उपचारित पौधों के मूल विभज्योतक में प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ़्रेग्मोप्लास्ट जैसी माइटोटिक सूक्ष्मनलिका संरचनाएं देखीं। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS के अवलोकनों के अनुरूप, माइटोटिक सूक्ष्मनलिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय कमी देखी गई (चित्र 6c)।
उप-कोशिकीय विभेदन पर KAND 11 की कोशिकाविषाक्तता को चिह्नित करने के लिए, हमने तंबाकू BY-2 निलंबन कोशिकाओं को KAND 11 से उपचारित किया और उनकी प्रतिक्रिया देखी। हमने सबसे पहले KAND 11 को TagRFP-TUA6 व्यक्त करने वाली BY-2 कोशिकाओं में जोड़ा, जो फ्लोरोसेंट रूप से सूक्ष्मनलिकाएं लेबल करती हैं, ताकि कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका पर KAND 11 के प्रभाव का आकलन किया जा सके। कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका घनत्व का आकलन छवि विश्लेषण का उपयोग करके किया गया, जिसने साइटोप्लाज्मिक पिक्सल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सल के प्रतिशत को निर्धारित किया। परख के परिणामों से पता चला कि 1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 के उपचार के बाद, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% या 0.23 ± 0.28% तक कम हो गया, ये परिणाम एराबिडोप्सिस में हुए अवलोकन के अनुरूप हैं कि KAND 11 उपचार कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के विध्रुवीकरण को प्रेरित करता है (चित्र 6b)। हमने KAND 11 की समान सांद्रता से उपचार के बाद GFP-ABD-लेबल वाले एक्टिन तंतुओं वाली BY-2 लाइन की भी जाँच की और पाया कि KAND 11 उपचार ने एक्टिन तंतुओं को बाधित कर दिया। 50 μM या 100 μM KAND 11 से 1 घंटे तक उपचार करने पर एक्टिन तंतु घनत्व क्रमशः 1.20 ± 0.62% या 0.61 ± 0.26% तक उल्लेखनीय रूप से कम हो गया, जबकि DMSO-उपचारित कोशिकाओं में घनत्व 1.69 ± 0.51% था (चित्र 2)। ये परिणाम प्रोपाइज़ामाइड, जो एक्टिन तंतुओं को प्रभावित नहीं करता, और लैट्रुनकुलिन बी, जो एक एक्टिन डीपॉलीमराइज़र है और सूक्ष्मनलिकाओं को प्रभावित नहीं करता, के प्रभावों के विपरीत हैं (एसआई चित्र एस6)। इसके अतिरिक्त, कौमामोनामाइड 1, कौमामोनामाइड अम्ल 6, या KAND 11 से उपचार ने हेला कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाओं को प्रभावित नहीं किया (एसआई चित्र एस7)। इस प्रकार, KAND 11 की क्रियाविधि ज्ञात साइटोस्केलेटन डिसरप्टर्स से भिन्न मानी जाती है। इसके अलावा, KAND 11 से उपचारित BY-2 कोशिकाओं के हमारे सूक्ष्म अवलोकन से KAND 11 उपचार के दौरान कोशिका मृत्यु की शुरुआत का पता चला और यह भी पता चला कि KAND 11 उपचार के 30 मिनट बाद इवांस ब्लू-रंजित मृत कोशिकाओं का अनुपात उल्लेखनीय रूप से नहीं बढ़ा, जबकि 50 μM या 100 μM KAND से 90 मिनट के उपचार के बाद, मृत कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 43.7% या 80.1% तक बढ़ गई (चित्र 7c)। कुल मिलाकर, ये आँकड़े दर्शाते हैं कि नया उर्सोलिक अम्ल व्युत्पन्न KAND 11 एक पादप-विशिष्ट कोशिका-कंकाल अवरोधक है जिसकी क्रियाविधि पहले अज्ञात थी।
KAND कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं, एक्टिन तंतुओं और तंबाकू BY-2 कोशिकाओं की जीवनक्षमता को प्रभावित करता है। (a) TagRFP-TUA6 की उपस्थिति में BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं का दृश्य। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षण किया गया। कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका घनत्व की गणना 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से की गई। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी HSD परीक्षण, पृष्ठ< 0.05)। स्केल बार = 10 µm. (b) GFP-ABD2 की उपस्थिति में BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल एक्टिन तंतु देखे गए। KAND 11 (50 µM या 100 µM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षण किया गया। कॉर्टिकल एक्टिन तंतुओं का घनत्व 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से परिकलित किया गया। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी HSD परीक्षण, पृष्ठ< 0.05)। स्केल बार = 10 µm. (c) इवांस ब्लू अभिरंजन द्वारा मृत BY-2 कोशिकाओं का अवलोकन। KAND 11 (50 µM या 100 µM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं का ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षण किया गया। n=3. स्केल बार = 100 µm.
नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज और अनुप्रयोग ने चिकित्सा और कृषि सहित मानव जीवन के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण प्रगति की है। प्राकृतिक संसाधनों से उपयोगी यौगिक प्राप्त करने के लिए ऐतिहासिक शोध किए गए हैं। विशेष रूप से, एक्टिनोमाइसीट्स को सूत्रकृमियों के लिए परजीवी-रोधी एंटीबायोटिक के रूप में उपयोगी माना जाता है क्योंकि इनमें विभिन्न द्वितीयक उपापचयजों, जैसे एवरमेक्टिन, जो आइवरमेक्टिन और ब्लियोमाइसिन का प्रमुख यौगिक है और इसके व्युत्पन्नों का औषधीय उपयोग कैंसर-रोधी कारक के रूप में होता है, उत्पन्न करने की क्षमता होती है21,22। इसी प्रकार, एक्टिनोमाइसीट्स से विभिन्न प्रकार के शाकनाशी यौगिकों की खोज की गई है, जिनमें से कुछ का व्यावसायिक उपयोग पहले से ही हो रहा है1,23। इसलिए, वांछित जैविक गतिविधियों वाले प्राकृतिक उत्पादों को पृथक करने के लिए एक्टिनोमाइसीट उपापचयजों का विश्लेषण एक प्रभावी रणनीति मानी जाती है। इस अध्ययन में, हमने एस. वेराएंसिस से एक नए यौगिक, कौमामोनामाइड, की खोज की और इसे सफलतापूर्वक संश्लेषित किया। उर्सोनिक अम्ल, अर्बेनामाइड और इसके व्युत्पन्नों का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती है। यह विशिष्ट जड़ कर्लिंग का कारण बन सकता है, मध्यम से तीव्र शाकनाशी क्रिया प्रदर्शित कर सकता है, और प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से पौधों की सूक्ष्मनलिकाओं को नुकसान पहुँचा सकता है। हालाँकि, उर्मोटोनिक अम्ल की क्रियाविधि मौजूदा सूक्ष्मनलिका अवरोधकों से भिन्न हो सकती है, क्योंकि KAND 11 एक्टिन तंतुओं को भी बाधित करता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, जो एक नियामक क्रियाविधि का सुझाव देता है जिसके द्वारा उर्मोटोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न कोशिका-कंकालीय संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करते हैं।
अर्बेनोनिक अम्ल के विस्तृत लक्षण-चित्रण से अर्बेनोनिक अम्ल की क्रियाविधि को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। विशेष रूप से, अगला लक्ष्य उर्सोनिक अम्ल की अपचयित सूक्ष्मनलिकाओं से बंध जाने की क्षमता का मूल्यांकन करना है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या उर्सोनिक अम्ल और उसके व्युत्पन्न सूक्ष्मनलिकाओं पर सीधे क्रिया करके उन्हें विबहुलीकृत करते हैं, या उनकी क्रिया के परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिकाएँ अस्थिर हो जाती हैं। इसके अतिरिक्त, जहाँ सूक्ष्मनलिकाएँ प्रत्यक्ष लक्ष्य नहीं हैं, वहाँ पादप कोशिकाओं पर उर्सोनिक अम्ल की क्रिया स्थल और आणविक लक्ष्यों की पहचान करने से संबंधित यौगिकों के गुणों और शाकनाशी क्रियाविधि में सुधार के संभावित तरीकों को और बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। हमारे जैवसक्रियता परीक्षण ने अरेबिडोप्सिस थालियाना, तम्बाकू और लिवरवॉर्ट जैसे पौधों की वृद्धि पर उर्सोनिक अम्ल की अद्वितीय कोशिकाविषाक्तता का खुलासा किया, जबकि न तो ई. कोलाई और न ही हेला कोशिकाएँ प्रभावित हुईं। यदि उर्सोनिक अम्ल व्युत्पन्नों को खुले कृषि क्षेत्रों में उपयोग के लिए शाकनाशी के रूप में विकसित किया जाता है, तो पशु कोशिकाओं के लिए कम या कोई विषाक्तता नहीं होना उर्सोनिक अम्ल व्युत्पन्नों का एक लाभ है। दरअसल, चूँकि सूक्ष्मनलिकाएँ यूकेरियोट्स में सामान्य संरचनाएँ हैं, इसलिए पौधों में उनका चयनात्मक अवरोधन शाकनाशियों के लिए एक प्रमुख आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, प्रोपाइज़ामाइड, एक सूक्ष्मनलिका विबहुलकीकरण कारक जो सीधे ट्यूबुलिन से जुड़ता है और बहुलकीकरण को रोकता है, जंतु कोशिकाओं के लिए इसकी कम विषाक्तता के कारण शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है24। डिसोपाइरामाइड के विपरीत, संबंधित बेंजामाइड्स की अलग लक्ष्य विशिष्टताएँ होती हैं। पादप सूक्ष्मनलिकाओं के अलावा, RH-4032 या बेंजोक्सामाइड क्रमशः जंतु कोशिकाओं या ऊमाइसीट्स की सूक्ष्मनलिकाओं का भी अवरोधन करते हैं, और ज़ालिलामाइड का उपयोग इसकी कम फाइटोटॉक्सिसिटी25,26,27 के कारण कवकनाशी के रूप में किया जाता है। नव-खोजे गए भालू और उसके व्युत्पन्न पौधों के विरुद्ध चयनात्मक कोशिकाविषाक्तता प्रदर्शित करते हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य है कि आगे के संशोधन उनकी लक्ष्य विशिष्टता को बदल सकते हैं, जिससे रोगजनक कवकों या ऊमाइसीट्स के नियंत्रण के लिए संभावित रूप से अतिरिक्त व्युत्पन्न उपलब्ध हो सकते हैं।
अर्बेनोनिक अम्ल और उसके व्युत्पन्नों के अद्वितीय गुण उन्हें शाकनाशी के रूप में विकसित करने और अनुसंधान उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए उपयोगी हैं। पादप कोशिका के आकार को नियंत्रित करने में कोशिका कंकाल का महत्व सर्वविदित है। पूर्व के अध्ययनों से पता चला है कि पौधों ने रूपजनन को उचित रूप से नियंत्रित करने के लिए सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करके कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के जटिल तंत्र विकसित किए हैं। सूक्ष्मनलिका गतिविधि के नियमन के लिए उत्तरदायी बड़ी संख्या में अणुओं की पहचान की गई है, और संबंधित शोध अभी भी जारी है3,4,28। पादप कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के बारे में हमारी वर्तमान समझ कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के तंत्रों की पूरी तरह से व्याख्या नहीं करती है। उदाहरण के लिए, हालाँकि डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन दोनों सूक्ष्मनलिकाओं का विबहुलीकरण कर सकते हैं, डिसोपाइरामाइड जड़ों में गंभीर विकृति का कारण बनता है जबकि ओरिज़ेलिन का प्रभाव अपेक्षाकृत हल्का होता है। इसके अलावा, ट्यूबुलिन में उत्परिवर्तन, जो सूक्ष्मनलिकाओं को स्थिर करता है, जड़ों में डेक्सट्रोरोटेशन का भी कारण बनता है, जबकि पैक्लिटैक्सेल, जो सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को भी स्थिर करता है, ऐसा नहीं करता है। इसलिए, उर्सोलिक अम्ल के आणविक लक्ष्यों का अध्ययन और पहचान करने से पौधों के कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाओं के नियमन में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त होगी। इसी प्रकार, विकृत वृद्धि को बढ़ावा देने वाले रसायनों, जैसे डिसोपाइरामाइड, और कम प्रभावी रसायनों, जैसे ओरिज़ेलिन या कुमामोटरिक अम्ल, की भविष्य में तुलना से यह पता चलेगा कि विकृत वृद्धि कैसे होती है।
दूसरी ओर, प्रतिरक्षा-संबंधी कोशिका-कंकालीय पुनर्व्यवस्थाएँ, उर्सोनिक अम्ल की कोशिका-विषाक्तता की व्याख्या करने की एक अन्य संभावना हैं। किसी रोगाणु का संक्रमण या पादप कोशिकाओं में किसी एलिसिटर का प्रवेश कभी-कभी कोशिका-कंकाल के विनाश और तत्पश्चात कोशिका मृत्यु का कारण बनता है29। उदाहरण के लिए, ऊमाइसीट-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सैंथिन, तंबाकू कोशिका मृत्यु से पहले सूक्ष्मनलिकाओं और एक्टिन तंतुओं को नष्ट करने की सूचना मिली है, जैसा कि KAND उपचार30,31 के साथ होता है। उर्सोनिक अम्ल द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और कोशिकीय प्रतिक्रियाओं के बीच समानताओं ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि वे सामान्य कोशिकीय प्रक्रियाओं को सक्रिय करते हैं, हालाँकि क्रिप्टोक्सैंथिन की तुलना में उर्सोनिक अम्ल का प्रभाव अधिक तेज़ और प्रबल होता है। हालाँकि, अध्ययनों से पता चला है कि एक्टिन तंतुओं का विघटन स्वतःस्फूर्त कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है, जो हमेशा सूक्ष्मनलिका विघटन के साथ नहीं होती29। इसके अलावा, यह देखना बाकी है कि क्या रोगाणु या एलिसिटर, उर्सोनिक अम्ल व्युत्पन्नों की तरह विकृत जड़ वृद्धि का कारण बनते हैं। इस प्रकार, रक्षा प्रतिक्रियाओं और कोशिका कंकाल को जोड़ने वाला आणविक ज्ञान एक आकर्षक समस्या है जिस पर ध्यान दिया जाना चाहिए। यूरसोनिक अम्ल से संबंधित कम आणविक भार वाले यौगिकों और विभिन्न क्षमताओं वाले व्युत्पन्नों की उपस्थिति का उपयोग करके, वे अज्ञात कोशिकीय तंत्रों को लक्षित करने के अवसर प्रदान कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले नए यौगिकों की खोज और अनुप्रयोग, पादप कोशिका आकार निर्धारण में अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्रों को समझने के लिए शक्तिशाली विधियाँ प्रदान करेंगे। इस संदर्भ में, हाल ही में विकसित यौगिक उर्मोटोनिक अम्ल, जो सूक्ष्मनलिकाओं और एक्टिन तंतुओं को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है, सूक्ष्मनलिका नियंत्रण और इन अन्य तंत्रों के बीच संबंध को समझने का अवसर प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, उर्बेनोनिक अम्ल का उपयोग करके रासायनिक और जैविक विश्लेषण हमें पादप कोशिका कंकाल को नियंत्रित करने वाले आणविक नियामक तंत्रों को समझने में मदद करेगा।
एस. वेरेंसिस MK493-CF1 को 500 मिलीलीटर के एक बफ़ल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्क में डालें जिसमें 110 मिलीलीटर बीज माध्यम हो जिसमें 2% (w/v) गैलेक्टोज़, 2% (w/v) एसेंस पेस्ट, 1% (w/v) बैक्टो कम्पोजिशन -सोयाटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.), 0.5% (w/v) कॉर्न एक्सट्रेक्ट (KOGOSTCH Co., Ltd., जापान), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 और 0.2% CaCO3 विआयनीकृत जल में हो। (स्टरलाइज़ेशन से पहले pH 7.4)। बीज संवर्धनों को एक रोटरी शेकर (180 rpm) पर 27°C पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया। ठोस अवस्था किण्वन के माध्यम से उत्पादन संवर्धन। बीज संवर्धन (7 मिली) को 500 मिली K-1 फ्लास्क में स्थानांतरित किया गया जिसमें 40 ग्राम उत्पादन माध्यम था जिसमें 15 ग्राम दबाया हुआ जौ (MUSO Co., Ltd., जापान) और 25 ग्राम विआयनीकृत पानी (निर्जलीकरण से पहले पीएच समायोजित नहीं किया गया) था। किण्वन 14 दिनों के लिए अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था। किण्वन सामग्री को 40 मिली/बोतल EtOH के साथ निकाला गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (1500 ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट)। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (60 मिली) 10% MeOH/EtOAc के मिश्रण के साथ निकाला गया था। अवशेष (59.5 मिलीग्राम) प्राप्त करने के लिए कार्बनिक परत को कम दबाव में वाष्पित किया गया था, जिसे रिवर्स फेज कॉलम (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 मिमी × लंबाई 250 मिमी) H2O/CH3CN पर ग्रेडिएंट एल्यूशन (0-10 मिनट: 90%) के साथ HPLC के अधीन किया गया था, 10-35 मिनट: 90% H2O/CH3CN से 70% H2O/CH3CN (ग्रेडिएंट), 35-45 मिनट: 90% H2O/EtOH, 45-155 मिनट: 90% H2O/EtOH से 100% EtOH (ग्रेडिएंट (ग्रेडिएंट), 155-200 मिनट: 100% EtOH) 1.5 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर, कौमामोनामाइड (1,
कुमामोटोएमाइड(1); 1H-NMR (500 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ईएसआई-एचआरएमएस [एम+एच]+: [सी6एच9एन2ओ2]+ गणना मूल्य: 141.0659, मापा मूल्य: 141.0663, आईआर νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 सेमी–1।
कोलंबिया के बीज (Col-0) शोध उपयोग हेतु अनुमति के साथ अरेबिडोप्सिस जैविक संसाधन केंद्र (ABRC) से प्राप्त किए गए थे। Col-0 के बीजों का हमारी प्रयोगशाला स्थितियों में प्रसार और रखरखाव किया गया और जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस पौधों के रूप में उपयोग किया गया। अरेबिडोप्सिस के बीजों को सतही रूप से जीवाणुरहित किया गया और अर्ध-शक्ति वाले मुराशिगे और स्कोग माध्यम में संवर्धित किया गया, जिसमें 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल), 0.05% (w/v) 2-(4-मॉर्फोलिनो)एथेनसल्फोनिक अम्ल (MES) (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) और 1.5% अगर (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल), pH 5.7, 23°C और निरंतर प्रकाश में था। phs1-1 उत्परिवर्ती के बीज टी. हाशिमोटो (नारा विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी संस्थान) द्वारा प्रदान किए गए थे।
एसआर-1 प्रजाति के बीज टी. हाशिमोटो (नारा विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी संस्थान) द्वारा प्रदान किए गए और जंगली प्रकार के तम्बाकू पौधों के रूप में उपयोग किए गए। तम्बाकू के बीजों को सतह से जीवाणुरहित किया गया और अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए तीन रातों तक जीवाणुरहित पानी में भिगोया गया, फिर 2% सुक्रोज, 0.05% (w/v) एमईएस, और 0.8% जेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) मुराशिगे और स्कूग माध्यम) युक्त अर्ध-शक्ति घोल में पीएच 5.7 के साथ रखा गया और निरंतर प्रकाश में 23°C पर इनक्यूबेट किया गया।
स्ट्रेन टैक-1 टी. कोची (क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान किया गया था और लिवरवॉर्ट अध्ययन के लिए मानक प्रायोगिक इकाई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जेम्मा को जीवाणुरहित संवर्धित पौधों से प्राप्त किया गया और फिर 1% सुक्रोज और 0.3% जेलन गम युक्त गैम्बोर्ग बी5 माध्यम (फ़ूजीफ़िल्म वाको प्योर केमिकल) पर चढ़ाया गया और निरंतर प्रकाश में 23°C पर इनक्यूबेट किया गया।
तंबाकू BY-2 कोशिकाएं (निकोटियाना टैबैकम एल. सीवी. ब्राइट येलो 2) एस. हसेजावा (टोक्यो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गईं। BY-2 कोशिकाओं को संशोधित लिंसमीयर और स्कोग माध्यम में 95 गुना पतला किया गया और 2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसिटिक एसिड 32 के साथ साप्ताहिक रूप से पूरक किया गया। सेल निलंबन को अंधेरे में 27°C पर 130 आरपीएम पर एक रोटरी शेकर पर मिलाया गया था। कोशिकाओं को ताजा माध्यम की मात्रा के 10 गुना के साथ धो लें और उसी माध्यम में फिर से निलंबित कर दें। फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर के तहत माइक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 या एक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 को स्थिर रूप से व्यक्त करने वाली BY-2 ट्रांसजेनिक सेल लाइनें वर्णित 33,34,35 के अनुसार उत्पन्न की गईं।
हेला कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37°C इनक्यूबेटर में डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलिन और 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ संवर्धित किया गया।
इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग जापानी जैव सुरक्षा नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
यौगिकों को स्टॉक विलयन के रूप में डाइमिथाइल सल्फॉक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) में घोला गया और अरेबिडोप्सिस और तंबाकू के लिए MS माध्यम में या लिवरवॉर्ट के लिए गैम्बोर्ग B5 माध्यम में तनु किया गया। जड़ वृद्धि अवरोध परख के लिए, प्रति प्लेट 10 से अधिक बीजों को अगर माध्यम में संकेतित यौगिक या DMSO युक्त बोया गया। बीजों को 7 दिनों के लिए एक वृद्धि कक्ष में रखा गया। पौधों की तस्वीरें ली गईं और जड़ों की लंबाई मापी गई। अरेबिडोप्सिस अंकुरण परख के लिए, प्रति प्लेट 48 बीजों को 200 μM यौगिक या DMSO युक्त अगर माध्यम में बोया गया। अरेबिडोप्सिस के बीजों को एक वृद्धि कक्ष में उगाया गया और अंकुरित पौधों की संख्या अंकुरण के 7 दिन बाद गिनी गई (dag)। तंबाकू अंकुरण परख के लिए, लिवरवॉर्ट वृद्धि अवरोधन परख के लिए, प्रत्येक प्लेट से 9 भ्रूणों को KAND या DMSO की संकेतित सांद्रता वाले अगर माध्यम पर रखा गया और 14 दिनों के लिए वृद्धि कक्ष में रखा गया।
जड़ विभज्योतक संगठन को देखने के लिए 5 मि.ग्रा./मि.ली. प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) से अभिरंजित पौधों का उपयोग करें। PI संकेतों का अवलोकन TCS SPE कॉन्फोकल लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा किया गया।
मालामी और बेनफी द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार जड़ों का β-ग्लुकुरोनिडेस (GUS) से ऊतक-रासायनिक अभिरंजन किया गया। पौधों को रात भर 90% एसीटोन में रखा गया, 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-d-ग्लुकुरोनिक अम्ल से GUS बफर में 1 घंटे तक अभिरंजित किया गया और हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड विलयन (8 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 2 मिली जल और 1 मिली ग्लिसरॉल) में रखा गया और एक्सियो इमेजर M1 माइक्रोस्कोप (कार्ल ज़ीस) का उपयोग करके विभेदक व्यतिकरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रेक्षण किया गया।
ऊर्ध्वाधर रूप से रखी प्लेटों पर उगाए गए 7 दिन पुराने पौधों पर जड़ कोण मापे गए। चरण 6 में बताए अनुसार गुरुत्व सदिश की दिशा से जड़ का कोण मापें।
प्रोटोकॉल 37 में मामूली संशोधनों के साथ, कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स की व्यवस्था वर्णित अनुसार देखी गई। एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) और एलेक्सा फ्लोरो 488-संयुग्मित एंटी-माउस IgG (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A32723) को क्रमशः 1:1000 और 1:100 तनुकरणों पर प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया। प्रतिदीप्ति चित्र TCS SPE कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems) का उपयोग करके प्राप्त किए गए। निर्माता के निर्देशों के अनुसार Z-स्टैक चित्र प्राप्त करें और अधिकतम तीव्रता के प्रक्षेपण बनाएँ।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके हेला कोशिका प्रसार परख किया गया।
ई. कोलाई DH5α की वृद्धि का विश्लेषण 600 एनएम (OD600) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संवर्धन में कोशिका घनत्व को मापकर किया गया।
ट्रांसजेनिक BY-2 कोशिकाओं में कोशिका-कंकालीय संगठन का अवलोकन एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके किया गया, जो एक CSU-X1 कॉन्फोकल स्कैनिंग उपकरण (योकोगावा) और एक sCMOS कैमरा (ज़ाइला, एंडोर टेक्नोलॉजी) से सुसज्जित था। छवि विश्लेषण द्वारा कोशिका-कंकालीय घनत्व का आकलन किया गया, जिसमें इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों में कोशिकाद्रव्यी पिक्सेल के बीच कोशिका-कंकालीय पिक्सेल के प्रतिशत का परिमाणन किया गया, जैसा कि वर्णित है38,39।
BY-2 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए, कोशिका निलंबन के एक अंश को कमरे के तापमान पर 0.05% इवांस ब्लू के साथ 10 मिनट के लिए संवर्धित किया गया। मृत कोशिकाओं का चयनात्मक इवांस ब्लू अभिरंजन, अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली40 द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं से रंग के निष्कासन पर निर्भर करता है। अभिरंजित कोशिकाओं का अवलोकन एक ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोप (BX53, ओलंपस) का उपयोग करके किया गया।
हेला कोशिकाओं को 37°C और 5% CO2 के आर्द्र इनक्यूबेटर में 10% FBS युक्त DMEM में उगाया गया। कोशिकाओं को 37°C पर 6 घंटे के लिए 100 μM KAND 11, कुमामोनामिक अम्ल 6, कुमामोनामाइड 1, 100 ng/ml कोलसेमिड (गिब्को), या 100 ng/ml नोकोडमेज़ (सिग्मा) से उपचारित किया गया। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए MetOH और फिर 5 मिनट के लिए एसीटेट के साथ स्थिर किया गया। स्थिर कोशिकाओं को 0.5% BSA/PBS में तनुकृत β-ट्यूबुलिन प्राथमिक प्रतिरक्षी (1D4A4, प्रोटीनटेक: 66240-1) के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, TBST से 3 बार धोया गया, और फिर एलेक्सा फ्लोर बकरी प्रतिरक्षी के साथ इनक्यूबेट किया गया। 488 1 घंटा। – माउस आईजीजी (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A11001) और 15 एनजी/एमएल 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) को 0.5% बीएसए/पीबीएस में घोला गया। टीबीएसटी से तीन बार धोने के बाद, निकॉन एक्लिप्स टीआई-ई उल्टे माइक्रोस्कोप पर अभिरंजित कोशिकाओं का अवलोकन किया गया। मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर (मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) का उपयोग करके एक ठंडे हमामात्सु ओआरसीए-आर2 सीसीडी कैमरे से चित्र लिए गए।