पौधों के सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित करने वाले नए पौधों के विकास अवरोधकों के रूप में उर्सा मोनोएमाइड्स की खोज, लक्षण वर्णन और कार्यात्मक सुधार।

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प्राकृतिक उत्पादों की खोज और लाभकारी उपयोग मानव जीवन को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है।पौधों की वृद्धि को रोकने वाले रसायनों का व्यापक रूप से खरपतवारों को नियंत्रित करने के लिए शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है।विभिन्न प्रकार के शाकनाशियों के उपयोग की आवश्यकता के कारण, क्रिया के नए तंत्र वाले यौगिकों की पहचान करने की आवश्यकता है।इस अध्ययन में, हमने स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेन्सिस एमके493-सीएफ1 से एक नवीन एन-अल्कोक्सीपायरोल यौगिक, कूमामोनमाइड की खोज की और संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित की।जैविक गतिविधि परीक्षणों के माध्यम से, हमने पाया कि उर्स-मोनोअमिक एसिड उर्स-मोनोएमाइड का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती और एक संभावित हैपौधे की वृद्धि अवरोधक.इसके अलावा, हमने विभिन्न अर्बेनोनिक एसिड डेरिवेटिव विकसित किए हैं, जिसमें अर्बेनिलॉक्सी डेरिवेटिव (यूडीए) भी शामिल है, जिसमें हेला कोशिकाओं के विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना उच्च जड़ी-बूटी गतिविधि होती है।हमने यह भी पाया कि उर्मोटोनिक एसिड डेरिवेटिव पौधों के सूक्ष्मनलिकाएं को बाधित करते हैं;इसके अलावा, KAND एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है;ये बहुआयामी प्रभाव ज्ञात सूक्ष्मनलिकात्मक अवरोधकों से भिन्न हैं और उर्सोनिक एसिड के लिए क्रिया के एक नए तंत्र का सुझाव देते हैं, जो नए जड़ी-बूटियों के विकास में एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है।
लाभकारी प्राकृतिक उत्पादों और उनके व्युत्पन्नों की खोज और व्यावहारिक अनुप्रयोग मानव जीवन की गुणवत्ता में सुधार का एक साधन है।सूक्ष्मजीवों, पौधों और कीड़ों द्वारा उत्पादित माध्यमिक मेटाबोलाइट्स ने चिकित्सा और कृषि में प्रमुख प्रगति की है।प्राकृतिक उत्पादों से कई एंटीबायोटिक और ल्यूकेमिया रोधी दवाएं विकसित की गई हैं।इसके अलावा विभिन्न प्रकार केकीटनाशककृषि में उपयोग के लिए इन प्राकृतिक उत्पादों से कवकनाशी और शाकनाशी निकाले जाते हैं।विशेष रूप से, आधुनिक कृषि में फसल की पैदावार बढ़ाने के लिए खरपतवार नियंत्रण शाकनाशी महत्वपूर्ण उपकरण हैं, और विभिन्न प्रकार के यौगिकों का पहले से ही व्यावसायिक रूप से उपयोग किया जाता है।पौधों में कई सेलुलर प्रक्रियाएं, जैसे प्रकाश संश्लेषण, अमीनो एसिड चयापचय, कोशिका दीवार संश्लेषण, माइटोसिस का विनियमन, फाइटोहोर्मोन सिग्नलिंग, या प्रोटीन संश्लेषण, को शाकनाशी के विशिष्ट लक्ष्य माना जाता है।ऐसे यौगिक जो सूक्ष्मनलिकात्मक कार्य को बाधित करते हैं, शाकनाशी का एक सामान्य वर्ग है जो माइटोटिक विनियमन2 को प्रभावित करके पौधों की वृद्धि को प्रभावित करते हैं।
सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन के घटक हैं और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से संरक्षित हैं।ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर में α-ट्यूबुलिन और β-ट्यूबुलिन होते हैं जो रैखिक सूक्ष्मनलिकाएं प्रोटोफिलामेंट्स बनाते हैं, जिसमें 13 प्रोटोफिलामेंट्स एक बेलनाकार संरचना बनाते हैं।सूक्ष्मनलिकाएं पादप कोशिकाओं में कई भूमिकाएं निभाती हैं, जिनमें कोशिका आकार, कोशिका विभाजन और अंतःकोशिकीय परिवहन3,4 का निर्धारण शामिल है।पादप कोशिकाओं में इंटरफेज़ प्लाज्मा झिल्ली के नीचे सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, और माना जाता है कि ये तथाकथित कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं सेल्यूलोज सिंथेज़ कॉम्प्लेक्स4,5 के विनियमन के माध्यम से सेल्यूलोज माइक्रोफाइब्रिल के संगठन को नियंत्रित करते हैं।जड़ की नोक के तेजी से बढ़ाव के क्षेत्र में मौजूद जड़ एपिडर्मल कोशिकाओं के कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं पार्श्व में स्थित होती हैं, और सेलूलोज़ माइक्रोफाइबर इन सूक्ष्मनलिकाएं का पालन करते हैं और कोशिका विस्तार की दिशा को सीमित करते हैं, जिससे अनिसोट्रोपिक कोशिका बढ़ाव को बढ़ावा मिलता है।इसलिए, सूक्ष्मनलिका कार्य का पादप आकृति विज्ञान से गहरा संबंध है।ट्युबुलिन को कूटने वाले जीन में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के कारण कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों में विकृति आती है और एराबिडोप्सिस 6,7 में बाएं या दाएं तरफा वृद्धि होती है।इसी प्रकार, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन में उत्परिवर्तन जो सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करते हैं, विकृत जड़ वृद्धि 8,9,10,11,12,13 का कारण बन सकते हैं।इसके अलावा, सूक्ष्मनलिका-विघटनकारी जड़ी-बूटियों जैसे डिसोपाइरामाइड, जिसे प्रीटीलाक्लोर भी कहा जाता है, के साथ उपचार से भी बाईं ओर तिरछी जड़ वृद्धि होती है।इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि पौधों की वृद्धि की दिशा निर्धारित करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं कार्य का सटीक विनियमन महत्वपूर्ण है।
विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मनलिकात्मक अवरोधकों की खोज की गई है, और इन दवाओं ने साइटोस्केलेटल अनुसंधान के साथ-साथ कृषि और चिकित्सा2 में महत्वपूर्ण योगदान दिया है।विशेष रूप से, ओरिज़ेलिन, डाइनिट्रोएनिलीन यौगिक, डिसोपाइरामाइड, बेंज़ामाइड-संबंधित यौगिक और उनके एनालॉग सूक्ष्मनलिका कार्य को बाधित कर सकते हैं और इस तरह पौधों के विकास को रोक सकते हैं।इसलिए, इन्हें व्यापक रूप से शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है।हालाँकि, चूंकि सूक्ष्मनलिकाएं पौधे और पशु कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घटक हैं, अधिकांश सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधक दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक हैं।इसलिए, शाकनाशी के रूप में उनकी मान्यता प्राप्त उपयोगिता के बावजूद, व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए सीमित संख्या में एंटीमाइक्रोट्यूब्यूल एजेंटों का उपयोग किया जाता है।
स्ट्रेप्टोमाइसेस स्ट्रेप्टोमाइसेस परिवार की एक प्रजाति है, जिसमें एरोबिक, ग्राम-पॉजिटिव, फिलामेंटस बैक्टीरिया शामिल हैं और व्यापक रूप से माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्पादन करने की क्षमता के लिए जाना जाता है।इसलिए, इसे नए जैविक रूप से सक्रिय प्राकृतिक उत्पादों के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक माना जाता है।वर्तमान अध्ययन में, हमने कूमामोनमाइड नामक एक नए यौगिक की खोज की, जिसे स्ट्रेप्टोमाइसेस वेरेन्सिस एमके493-सीएफ1 और एस. वेरेन्सिस आईएसपी 5486 से अलग किया गया था। वर्णक्रमीय विश्लेषण और पूर्ण वर्णक्रमीय विश्लेषण का उपयोग करते हुए, कूमामोनमाइड की संरचना और इसके अद्वितीय एन-अल्कोक्सीपायरोल कंकाल की विशेषता बताई गई थी। निश्चय कर रखा था।संश्लेषण।उर्स्मोनिक एसिड, उर्स्मोनोएमाइड और उसके डेरिवेटिव का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती, लोकप्रिय मॉडल प्लांट अरेबिडोप्सिस थालियाना के विकास और अंकुरण को रोकता पाया गया था।संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन में, हमने पाया कि उर्सोनिक एसिड में संशोधित C9 वाला एक यौगिक, जिसे उर्सोनिक एसिड का नोनीलॉक्सी व्युत्पन्न (KAND) कहा जाता है, विकास और अंकुरण पर निरोधात्मक प्रभाव को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है।विशेष रूप से, नए खोजे गए पौधे के विकास अवरोधक ने तम्बाकू और लिवरवॉर्ट के विकास को भी प्रभावित किया और बैक्टीरिया या हेला कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक नहीं था।इसके अलावा, कुछ उर्मोटोनिक एसिड डेरिवेटिव एक विकृत रूट फेनोटाइप को प्रेरित करते हैं, जिसका अर्थ है कि ये डेरिवेटिव प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित करते हैं।इस विचार के अनुरूप, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए सूक्ष्मनलिकाएं के हमारे अवलोकन से संकेत मिलता है कि KAND उपचार सूक्ष्मनलिकाएं को डीपोलाइमराइज़ करता है।इसके अलावा, कुमामोटोनिक एसिड डेरिवेटिव के साथ उपचार ने एक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स को बाधित कर दिया।इस प्रकार, हमने एक नए पौधे के विकास अवरोधक की खोज की है जिसकी अनूठी क्रिया प्रणाली में साइटोस्केलेटन का विनाश शामिल है।
स्ट्रेन MK493-CF1 को शिनागावा-कू, टोक्यो में मिट्टी से अलग किया गया था।स्ट्रेन MK493-CF1 ने अच्छी तरह से शाखाओं वाले स्ट्रोमल मायसेलियम का निर्माण किया।16एस राइबोसोमल आरएनए जीन (1422 बीपी) का आंशिक अनुक्रम निर्धारित किया गया था।यह स्ट्रेन एस. वेरेन्सिस (एनबीआरसी 13404टी = आईएसपी 5486, 1421/1422 बीपी, टी: विशिष्ट स्ट्रेन, 99.93%) के समान है।इस परिणाम के आधार पर, यह निर्धारित किया गया कि यह स्ट्रेन एस. वेरेन्सिस के प्रकार के स्ट्रेन से निकटता से संबंधित था।इसलिए, हमने अस्थायी रूप से इस स्ट्रेन का नाम S. werraensis MK493-CF1 रखा है।S. werraensis ISP 5486T भी समान बायोएक्टिव यौगिकों का उत्पादन करता है।चूँकि इस सूक्ष्मजीव से प्राकृतिक उत्पाद प्राप्त करने के बारे में प्रारंभिक शोध बहुत कम था, इसलिए आगे रासायनिक शोध किया गया।14 दिनों के लिए 30°C पर ठोस-अवस्था किण्वन द्वारा जौ माध्यम पर एस. वेरेन्सिस MK493-CF1 की खेती के बाद, माध्यम को 50% EtOH के साथ निकाला गया था।59.5 मिलीग्राम कच्चा अर्क प्राप्त करने के लिए 60 मिलीलीटर नमूने को सुखाया गया।क्रूड अर्क को एन-मेथॉक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड (1, जिसे कूमामोनमाइड नाम दिया गया, 36.0 मिलीग्राम) देने के लिए रिवर्स चरण एचपीएलसी के अधीन किया गया था।1 की कुल मात्रा कच्चे तेल के अर्क का लगभग 60% है।इसलिए, हमने कुमामोटोएमाइड 1 के गुणों का विस्तार से अध्ययन करने का निर्णय लिया।
कौमामोनमाइड 1 एक सफेद अनाकार पाउडर है और उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 (चित्र 1) की पुष्टि करता है।इस यौगिक के C2-प्रतिस्थापित पाइरोल टुकड़े की विशेषता δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR स्पेक्ट्रम में है: 4.5 Hz , H-5) और δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), और 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन परमाणुओं की उपस्थिति दर्शाता है।C2 स्थिति में एक एमाइड समूह की उपस्थिति का मूल्यांकन δC 161.1 पर C-3 प्रोटॉन से एमाइड कार्बोनिल कार्बन के HMBC सहसंबंध द्वारा किया गया था।इसके अलावा, δH 4.10 (3H, S) और δC 68.3 पर 1 H और 13 C NMR शिखर अणु में N-मेथॉक्सी समूहों की उपस्थिति का संकेत देते हैं।यद्यपि मेथॉक्सी समूह की सही स्थिति अभी तक स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण जैसे कि उन्नत अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु ओवरहाउसर संक्षेप (एनओईडीएफ) का उपयोग करके निर्धारित नहीं की गई है, एन-मेथॉक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड पहला उम्मीदवार यौगिक बन गया।
1 की सही संरचना निर्धारित करने के लिए, कुल संश्लेषण किया गया (चित्र 2ए)।एम-सीपीबीए के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-एमिनोपाइरीडीन 2 के उपचार के परिणामस्वरूप मात्रात्मक उपज में एन-ऑक्साइड 3 प्राप्त हुआ।2 के 2-अमीनोएज़िडेशन के बाद, अब्रामोविच द्वारा वर्णित साइक्लोकॉन्डेंसेशन प्रतिक्रिया को ग्राम में वांछित 1-हाइड्रॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोनाइट्राइल 5 प्राप्त करने के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर बेंजीन में किया गया था।गति 60% (दो चरण)।15,16.4 के मिथाइलेशन और हाइड्रोलिसिस ने फिर 1-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (जिसे "क्यूमोटोनिक एसिड" कहा जाता है, 6) अच्छी उपज (70%, दो चरण) में दिया।अंत में, जलीय अमोनिया का उपयोग करके एसिड क्लोराइड मध्यवर्ती 6 के माध्यम से संशोधन से कुमामोटो एमाइड 1 में 98% उपज प्राप्त हुई।संश्लेषित 1 के सभी वर्णक्रमीय डेटा पृथक 1 के समान थे, इसलिए 1 की संरचना निर्धारित की गई थी;
अर्बेनामाइड और अर्बेनिक एसिड की जैविक गतिविधि का सामान्य संश्लेषण और विश्लेषण।(ए) कुमामोटो एमाइड का कुल संश्लेषण।(बी) सात दिन पुराने जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस कोलंबिया (कर्नल) के पौधे मुराशिगे और स्कूग (एमएस) प्लेटों पर उगाए गए थे जिनमें संकेतित सांद्रता में कूमामोनमाइड 6 या कूमामोनमाइड 1 था।स्केल बार = 1 सेमी.
सबसे पहले, हमने पौधों की वृद्धि को नियंत्रित करने की क्षमता के लिए अर्बेनामाइड और इसके मध्यवर्ती पदार्थों की जैविक गतिविधियों का आकलन किया।हमने एमएस अगर माध्यम में उर्सोनामाइड 1 या उर्स्मोनिक एसिड 6 की विभिन्न सांद्रताएं जोड़ीं और इस माध्यम पर अरेबिडोप्सिस थालियाना के पौधे रोपे।इन जांचों से पता चला कि 6 की उच्च सांद्रता (500 μM) ने जड़ वृद्धि को बाधित कर दिया (चित्र 2 बी)।इसके बाद, हमने 6 की एन1 स्थिति को प्रतिस्थापित करके विभिन्न डेरिवेटिव तैयार किए और उन पर संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन किया (एनालॉग संश्लेषण प्रक्रिया सहायक सूचना (एसआई) में वर्णित है)।अरेबिडोप्सिस अंकुर 50 μM अर्सोनिक एसिड डेरिवेटिव वाले माध्यम पर उगाए गए थे, और जड़ की लंबाई मापी गई थी।जैसा कि चित्र पर दिखाया गया है।जैसा कि चित्र 3ए, बी और एस1 में दिखाया गया है, क्यूमामो एसिड में एन1 स्थिति पर रैखिक एल्कोक्सी श्रृंखला (9, 10, 11, 12, और 13) या बड़ी एल्कोक्सी श्रृंखला (15, 16, और 17) की अलग-अलग लंबाई होती है।डेरिवेटिव ने जड़ वृद्धि में महत्वपूर्ण अवरोध दिखाया।इसके अलावा, हमने पाया कि 200 μM 10, 11, या 17 के अनुप्रयोग ने अंकुरण को रोक दिया (चित्र 3सी और एस2)।
कुमामोटो एमाइड और संबंधित यौगिकों की संरचना-गतिविधि संबंध का अध्ययन।(ए) एनालॉग्स की संरचना और संश्लेषण योजना।(बी) 50 μM कूमामोनमाइड डेरिवेटिव के साथ या उसके बिना एमएस माध्यम पर उगाए गए 7 दिन पुराने पौधों की जड़ की लंबाई की मात्रा।तारांकन दिखावटी उपचार (टी परीक्षण, पृष्ठ) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं<0.05).n>18. डेटा को माध्य ± SD के रूप में दिखाया गया है।एनटी का अर्थ है "परीक्षण नहीं किया गया" क्योंकि 50% से अधिक बीज अंकुरित नहीं हुए।(सी) 200 μM कूमामोनमाइड और संबंधित यौगिकों के साथ या उसके बिना एमएस माध्यम में 7 दिनों के लिए उगाए गए उपचारित बीजों की अंकुरण दर की मात्रा।तारांकन दिखावटी उपचार (ची-स्क्वायर परीक्षण) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।एन=96.
दिलचस्प बात यह है कि C9 से अधिक लंबी एल्काइल साइड चेन को जोड़ने से निरोधात्मक गतिविधि कम हो गई, जिससे पता चला कि कुमामोटोइक एसिड-संबंधित यौगिकों को अपनी जैविक गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए एक निश्चित आकार की साइड चेन की आवश्यकता होती है।
क्योंकि संरचना-गतिविधि संबंध विश्लेषण से पता चला है कि C9 को उर्सोनिक एसिड में संशोधित किया गया था और उर्सोनिक एसिड का नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (इसके बाद KAND 11 के रूप में संदर्भित) सबसे प्रभावी पौधा विकास अवरोधक था, हमने KAND 11 का अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन किया। अरेबिडोप्सिस का उपचार 50 μM KAND 11 ने अंकुरण को लगभग पूरी तरह से रोक दिया, जबकि KAND 11 की कम सांद्रता (40, 30, 20, या 10 μM) ने खुराक पर निर्भर तरीके से जड़ वृद्धि को रोक दिया (चित्र 4 ए, बी)।यह जांचने के लिए कि क्या KAND 11 जड़ विभज्योतक व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, हमने प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) से रंगे जड़ विभज्योतक की जांच की और विभज्योतक क्षेत्र के आकार को मापा।25 μM KAND-11 वाले माध्यम पर उगाए गए पौधों के विभज्योतक का आकार 151.1 ± 32.5 μm था, जबकि DMSO युक्त नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों के विभज्योतक का आकार 264.7 ± 30.8 μm था (चित्र 4c, d) , जो इंगित करता है कि KAND-11 सेलुलर गतिविधि को पुनर्स्थापित करता है।फैल रहा है.जड़ विभज्योतक.इसके अनुरूप, KAND 11 उपचार ने रूट मेरिस्टेम में कोशिका विभाजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS सिग्नल की मात्रा कम कर दी (चित्र 4e) 17।इन परिणामों से संकेत मिलता है कि KAND 11 कोशिका प्रसार गतिविधि को कम करके जड़ वृद्धि को रोकता है।
विकास पर अर्बेनोनिक एसिड डेरिवेटिव (अर्बेनिलॉक्सी डेरिवेटिव) के निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण।(ए) केएनडी 11 की संकेतित सांद्रता के साथ एमएस प्लेटों पर उगाए गए 7 दिन पुराने जंगली प्रकार के कोल पौधे। स्केल बार = 1 सेमी।(बी) जड़ की लंबाई की मात्रा।पत्र महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी एचएसडी परीक्षण, पी<0.05).n>16. डेटा को माध्य ± SD के रूप में दिखाया गया है।(सी) 25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना एमएस प्लेटों पर उगाए गए प्रोपिडियम आयोडाइड-सना हुआ जंगली-प्रकार कोल जड़ों की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी। सफेद ब्रैकेट रूट मेरिस्टेम का संकेत देते हैं।स्केल बार = 100 µm.(डी) जड़ विभज्योतक आकार की मात्रा का निर्धारण (एन = 10 से 11)।सांख्यिकीय अंतर टी-टेस्ट (पी) का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे<0.05).पट्टियाँ औसत विभज्योतक आकार का प्रतिनिधित्व करती हैं।(ई) सीडीकेबी2 निर्माण वाले रूट मेरिस्टेम की डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी;1प्रो: सीडीकेबी2;25 µM KAND परख के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाए गए 5-दिवसीय अंकुरों पर 1-GUS का दाग और दाग।
KAND 11 की फाइटोटॉक्सिसिटी का परीक्षण एक अन्य डाइकोटाइलडोनस पौधे, तम्बाकू (निकोटियाना टैबैकम), और एक प्रमुख भूमि संयंत्र मॉडल जीव, लिवरवॉर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमोर्फा) का उपयोग करके किया गया था।जैसा कि एराबिडोप्सिस के मामले में, 25 μM KAND 11 वाले माध्यम पर उगाए गए तम्बाकू SR-1 पौधों से छोटी जड़ें पैदा हुईं (चित्र 5a)।इसके अतिरिक्त, 48 में से 40 बीज 200 μM KAND 11 युक्त प्लेटों पर अंकुरित हुए, जबकि सभी 48 बीज मॉक-ट्रीटेड मीडिया पर अंकुरित हुए, जो दर्शाता है कि KAND की उच्च सांद्रता महत्वपूर्ण थी (p)<0.05;ची टेस्ट-स्क्वायर) ने तम्बाकू के अंकुरण को रोक दिया।(चित्र 5बी)।इसके अलावा, KAND 11 की सांद्रता, जो लिवरवॉर्ट में बैक्टीरिया के विकास को रोकती थी, एराबिडोप्सिस (चित्र 5c) में प्रभावी सांद्रता के समान थी।इन परिणामों से संकेत मिलता है कि KAND 11 विभिन्न प्रकार के पौधों के विकास को रोक सकता है।फिर हमने क्रमशः उच्च पशु और जीवाणु कोशिकाओं के प्रतिनिधियों के रूप में अन्य जीवों, अर्थात् मानव हेला कोशिकाओं और एस्चेरिचिया कोली स्ट्रेन DH5α में भालू मोनोमाइड-संबंधित यौगिकों की संभावित साइटोटॉक्सिसिटी की जांच की।कोशिका प्रसार परीक्षणों की एक श्रृंखला में, हमने देखा कि कूमामोनमाइड 1, कूमामोनामिडिक एसिड 6, और केएएनडी 11 ने 100 μM (चित्र 5डी,ई) की सांद्रता पर हेला या ई. कोली कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं किया।
गैर-अरबीडोप्सिस जीवों में KAND 11 का विकास अवरोध।(ए) दो सप्ताह पुराने जंगली प्रकार के एसआर-1 तंबाकू के पौधे 25 μM KAND 11 वाली ऊर्ध्वाधर स्थिति वाली एमएस प्लेटों पर उगाए गए थे। (बी) दो सप्ताह पुराने जंगली प्रकार के एसआर-1 तंबाकू के पौधे क्षैतिज रूप से स्थित एमएस प्लेटों पर उगाए गए थे। 200 μM KAND 11 युक्त MS प्लेटें। (c) KAND 11 की संकेतित सांद्रता के साथ गैंबोर्ग B5 प्लेटों पर उगाई गई दो सप्ताह पुरानी जंगली-प्रकार की टैक-1 लिवरवॉर्ट कलियाँ। लाल तीर उन बीजाणुओं को इंगित करते हैं जिन्होंने दो सप्ताह के ऊष्मायन के भीतर बढ़ना बंद कर दिया है। अवधि।(डी) हेला कोशिकाओं का कोशिका प्रसार परख।सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को निश्चित समय अंतराल पर मापा गया था।नियंत्रण के रूप में, हेला कोशिकाओं को 5 μg/ml एक्टिनोमाइसिन डी (एक्ट डी) के साथ इलाज किया गया, जो आरएनए पोलीमरेज़ प्रतिलेखन को रोकता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है।विश्लेषण तीन प्रतियों में किया गया।(ई) ई. कोलाई कोशिका प्रसार परख।ई. कोलाई वृद्धि का विश्लेषण OD600 मापकर किया गया।नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को 50 μg/ml एम्पीसिलीन (Amp) से उपचारित किया गया, जो जीवाणु कोशिका दीवार संश्लेषण को रोकता है।विश्लेषण तीन प्रतियों में किया गया।
यूरामाइड-संबंधित यौगिकों के कारण होने वाली साइटोटॉक्सिसिटी की क्रिया के तंत्र को समझने के लिए, हमने मध्यम निरोधात्मक प्रभाव वाले अर्बेनिक एसिड डेरिवेटिव का पुनः विश्लेषण किया।जैसा कि चित्र पर दिखाया गया है।जैसा कि चित्र 2 बी, 6 ए में दिखाया गया है, उर्मोटोनिक एसिड 6 की उच्च सांद्रता (200 μM) युक्त आगर प्लेटों पर उगाए गए पौधों से छोटी और बाईं ओर मुड़ी हुई जड़ें (θ = - 23.7 ± 6.1) पैदा हुईं, जबकि नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों में, अंकुरों से लगभग सीधी जड़ें निकलीं (θ = – 3.8 ± 7.1)।यह विशिष्ट तिरछी वृद्धि कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं14,18 की शिथिलता के परिणामस्वरूप मानी जाती है।इस खोज के अनुरूप, सूक्ष्मनलिका-अस्थिर करने वाली दवाएं डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन ने हमारी विकास स्थितियों के तहत समान जड़ झुकाव को प्रेरित किया (चित्र 2 बी, 6 ए)।उसी समय, हमने उर्मोटोनिक एसिड डेरिवेटिव का परीक्षण किया और उनमें से कई का चयन किया, जो निश्चित सांद्रता पर, तिरछी जड़ वृद्धि को प्रेरित करते थे।यौगिक 8, 9, और 15 ने क्रमशः 75 μM, 50 μM, और 40 μM पर जड़ वृद्धि की दिशा बदल दी, यह दर्शाता है कि ये यौगिक सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावी ढंग से अस्थिर कर सकते हैं (चित्र 2बी, 6ए)।हमने सबसे शक्तिशाली उर्सोलिक एसिड व्युत्पन्न, KAND 11 का भी कम सांद्रता (15 µM) पर परीक्षण किया और पाया कि KAND 11 के अनुप्रयोग से जड़ वृद्धि बाधित हुई और जड़ वृद्धि की दिशा असमान थी, हालाँकि वे बाईं ओर ढलान पर थीं ( चित्र C3)..क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं-अस्थिर करने वाली दवाओं की उच्च सांद्रता कभी-कभी जड़ झुकने के बजाय पौधे के विकास को रोकती है, हमने बाद में इस संभावना का आकलन किया कि KAND 11 जड़ एपिडर्मल कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं देखकर सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित करता है।25 μM KAND 11 से उपचारित अंकुर की जड़ों की एपिडर्मल कोशिकाओं में एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने बढ़ाव क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में लगभग सभी कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं के गायब होने को दिखाया (चित्र 6 बी)।इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कुमामोटोनिक एसिड और इसके डेरिवेटिव सूक्ष्मनलिकाएं पर प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से कार्य करके उन्हें बाधित करते हैं और ये यौगिक नवीन सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधक हैं।
उर्सोनिक एसिड और इसके डेरिवेटिव एराबिडोप्सिस थालियाना में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं को बदल देते हैं।(ए) संकेतित सांद्रता पर विभिन्न उर्मोटोनिक एसिड डेरिवेटिव की उपस्थिति में जड़ झुकाव कोण को मापा जाता है।सूक्ष्मनलिकाएं को बाधित करने के लिए जाने जाने वाले दो यौगिकों: डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन के प्रभावों का भी विश्लेषण किया गया।इनसेट जड़ वृद्धि कोण को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक को दर्शाता है।तारांकन दिखावटी उपचार (टी परीक्षण, पृष्ठ) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं<0.05).n>19. स्केल बार = 1 सेमी.(बी) बढ़ाव क्षेत्र में एपिडर्मल कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं।25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना एमएस प्लेटों पर उगाए गए जंगली प्रकार के एराबिडोप्सिस कोल जड़ों में सूक्ष्मनलिकाएं β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी और एलेक्सा फ्लोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला द्वारा देखी गईं।स्केल बार = 10 µm.(सी) जड़ विभज्योतक में सूक्ष्मनलिकाएं की माइटोटिक संरचना।इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना की गई।प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ़्रैग्मोप्लास्ट सहित माइटोटिक संरचनाओं को कन्फोकल छवियों से गिना गया था।तीर माइटोटिक सूक्ष्मनलिकाएं संरचनाओं को इंगित करते हैं।तारांकन दिखावटी उपचार (टी परीक्षण, पृष्ठ) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं<0.05).n>9. स्केल बार = 50 µm.
यद्यपि उरसा में सूक्ष्मनलिकात्मक कार्य को बाधित करने की क्षमता है, लेकिन इसकी क्रिया का तंत्र विशिष्ट सूक्ष्मनलिका डीपोलिमराइजिंग एजेंटों से भिन्न होने की उम्मीद है।उदाहरण के लिए, डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ेलिन जैसे सूक्ष्मनलिकाएं डीपोलाइमराइजिंग एजेंटों की उच्च सांद्रता एपिडर्मल कोशिकाओं के अनिसोट्रोपिक विस्तार को प्रेरित करती है, जबकि KAND 11 ऐसा नहीं करता है।इसके अलावा, KAND 11 और डिसोपाइरामाइड के सह-अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप संयुक्त डिसोपाइरामाइड-प्रेरित जड़ वृद्धि प्रतिक्रिया हुई और KAND 11-प्रेरित विकास अवरोध देखा गया (चित्र S4)।हमने KAND 11 के प्रति हाइपरसेंसिटिव डिसोपाइरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्ती की प्रतिक्रिया का भी विश्लेषण किया। phs1-1 में एक गैर-विहित ट्यूबुलिन किनसे बिंदु उत्परिवर्तन होता है और डिसोपाइरामाइड9,20 के साथ इलाज करने पर छोटी जड़ें पैदा होती हैं।KAND 11 युक्त अगर माध्यम पर उगाए गए phs1-1 उत्परिवर्ती अंकुरों की जड़ें डिसोपाइरामिड (चित्र S5) पर उगाए गए पौधों के समान छोटी थीं।
इसके अलावा, हमने KAND 11 से उपचारित पौधों की जड़ विभज्योतक में माइटोटिक सूक्ष्मनलिकाएं संरचनाएं देखीं, जैसे कि प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ्रैग्मोप्लास्ट। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS के लिए टिप्पणियों के अनुरूप, में एक महत्वपूर्ण कमी माइटोटिक सूक्ष्मनलिकाएं की संख्या देखी गई (चित्र .6c)।
उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन पर KAND 11 की साइटोटॉक्सिसिटी को चिह्नित करने के लिए, हमने KAND 11 के साथ तम्बाकू BY-2 निलंबन कोशिकाओं का इलाज किया और उनकी प्रतिक्रिया देखी।हमने सबसे पहले टैगआरएफपी-टीयूए6 को व्यक्त करने वाली बीवाई-2 कोशिकाओं में केएएनडी 11 को जोड़ा, जो कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं पर केएएनडी 11 के प्रभाव का आकलन करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं को फ्लोरोसेंट रूप से लेबल करता है।छवि विश्लेषण का उपयोग करके कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका घनत्व का आकलन किया गया, जिसने साइटोप्लाज्मिक पिक्सल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सल का प्रतिशत निर्धारित किया।परख परिणामों से पता चला कि 1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 के साथ उपचार के बाद, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% या 0.23 ± 0.28% तक कम हो गया, जबकि DMSO के साथ इलाज की गई कोशिकाओं का घनत्व 1.61 ± 0.34 था। % (चित्र 7ए)।ये परिणाम एराबिडोप्सिस में अवलोकन के अनुरूप हैं कि KAND 11 उपचार कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स (छवि 6 बी) के डीपोलाइमराइजेशन को प्रेरित करता है।हमने KAND 11 की समान सांद्रता के साथ उपचार के बाद GFP-ABD-लेबल एक्टिन फिलामेंट्स के साथ BY-2 लाइन की भी जांच की और देखा कि KAND 11 उपचार ने एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित कर दिया।1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 के साथ उपचार से एक्टिन फिलामेंट घनत्व क्रमशः 1.20 ± 0.62% या 0.61 ± 0.26% तक कम हो गया, जबकि DMSO-उपचारित कोशिकाओं में घनत्व 1.69 ± 0.51% था (चित्र 2)।7बी).ये परिणाम प्रोपीज़ामाइड के प्रभावों के विपरीत हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित नहीं करता है, और लैट्रुनकुलिन बी, एक एक्टिन डीपोलाइमराइज़र जो सूक्ष्मनलिकाएं (एसआई चित्रा एस 6) को प्रभावित नहीं करता है।इसके अलावा, कूमामोनमाइड 1, कूमामोनमाइड एसिड 6, या केएएनडी 11 के साथ उपचार ने हेला कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित नहीं किया (एसआई चित्र एस7)।इस प्रकार, KAND 11 की क्रिया का तंत्र ज्ञात साइटोस्केलेटन अवरोधकों से भिन्न माना जाता है।इसके अलावा, KAND 11 से उपचारित BY-2 कोशिकाओं के हमारे सूक्ष्म अवलोकन से KAND 11 उपचार के दौरान कोशिका मृत्यु की शुरुआत का पता चला और पता चला कि KAND 11 उपचार के 30 मिनट के बाद इवांस के नीले-दाग वाले मृत कोशिकाओं के अनुपात में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं हुई, जबकि 50 μM या 100 μM KAND के साथ 90 मिनट के उपचार के बाद, मृत कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 43.7% या 80.1% तक बढ़ गई (चित्र 7सी)।कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि नया उर्सोलिक एसिड व्युत्पन्न KAND 11 एक पौधा-विशिष्ट साइटोस्केलेटल अवरोधक है, जिसकी क्रिया का तंत्र पहले से अज्ञात है।
KAND कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं, एक्टिन फिलामेंट्स और तंबाकू BY-2 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है।(ए) टैगआरएफपी-टीयूए6 की उपस्थिति में बीवाई-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं का दृश्य।KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं की जांच कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई।कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका घनत्व की गणना 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से की गई थी।पत्र महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी एचएसडी परीक्षण, पी<0.05).स्केल बार = 10 µm.(बी) बीवाई-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट्स को जीएफपी-एबीडी2 की उपस्थिति में देखा गया।KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं की जांच कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई।कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट्स के घनत्व की गणना 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से की गई थी।पत्र महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (ट्यूकी एचएसडी परीक्षण, पी<0.05).स्केल बार = 10 µm.(सी) इवांस ब्लू स्टेनिंग द्वारा मृत BY-2 कोशिकाओं का अवलोकन।KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं की जांच ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई।एन=3.स्केल बार = 100 µm.
नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज और अनुप्रयोग से चिकित्सा और कृषि सहित मानव जीवन के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है।प्राकृतिक संसाधनों से उपयोगी यौगिक प्राप्त करने के लिए ऐतिहासिक अनुसंधान किया गया है।विशेष रूप से, एक्टिनोमाइसेट्स को नेमाटोड के लिए एंटीपैरासिटिक एंटीबायोटिक्स के रूप में उपयोगी माना जाता है, क्योंकि वे विभिन्न माध्यमिक मेटाबोलाइट्स जैसे कि एवरमेक्टिन, आइवरमेक्टिन और ब्लोमाइसिन के प्रमुख यौगिक और इसके डेरिवेटिव का उत्पादन करने की क्षमता रखते हैं, जो औषधीय रूप से एक एंटीकैंसर एजेंट21,22 के रूप में उपयोग किया जाता है।इसी तरह, एक्टिनोमाइसेट्स से विभिन्न प्रकार के जड़ी-बूटी यौगिकों की खोज की गई है, जिनमें से कुछ का पहले से ही व्यावसायिक उपयोग1,23 किया जा चुका है।इसलिए, वांछित जैविक गतिविधियों के साथ प्राकृतिक उत्पादों को अलग करने के लिए एक्टिनोमाइसीट मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण एक प्रभावी रणनीति माना जाता है।इस अध्ययन में, हमने एस. वेरेन्सिस से एक नए यौगिक, कूमामोनमाइड की खोज की और इसे सफलतापूर्वक संश्लेषित किया।उर्सोनिक एसिड अर्बेनामाइड और उसके डेरिवेटिव का एक सिंथेटिक मध्यवर्ती है।यह विशिष्ट जड़ कर्लिंग का कारण बन सकता है, मध्यम से मजबूत शाकनाशी गतिविधि प्रदर्शित कर सकता है, और प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से पौधे के सूक्ष्मनलिकाएं को नुकसान पहुंचा सकता है।हालाँकि, उर्मोटोनिक एसिड की क्रिया का तंत्र मौजूदा सूक्ष्मनलिका अवरोधकों से भिन्न हो सकता है, क्योंकि KAND 11 एक्टिन फिलामेंट्स को भी बाधित करता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, जो एक नियामक तंत्र का सुझाव देता है जिसके द्वारा उर्मोटोनिक एसिड और इसके डेरिवेटिव साइटोस्केलेटल संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करते हैं।.
अर्बेनोनिक एसिड के आगे विस्तृत लक्षण वर्णन से अर्बेनोनिक एसिड की क्रिया के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी।विशेष रूप से, अगला लक्ष्य यह निर्धारित करने के लिए कम सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ने के लिए अर्सोनिक एसिड की क्षमता का मूल्यांकन करना है कि क्या अर्सोनिक एसिड और इसके डेरिवेटिव सीधे सूक्ष्मनलिकाएं पर कार्य करते हैं और उन्हें डीपोलीमराइज़ करते हैं, या क्या उनकी कार्रवाई के परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिकाएं अस्थिर हो जाती हैं।इसके अलावा, ऐसे मामले में जहां सूक्ष्मनलिकाएं प्रत्यक्ष लक्ष्य नहीं हैं, पौधों की कोशिकाओं पर कार्रवाई की साइट और अर्सोनिक एसिड के आणविक लक्ष्यों की पहचान करने से संबंधित यौगिकों के गुणों और जड़ी-बूटियों की गतिविधि में सुधार के संभावित तरीकों को समझने में मदद मिलेगी।हमारे बायोएक्टिविटी परीक्षण से अरबिडोप्सिस थालियाना, तंबाकू और लिवरवॉर्ट जैसे पौधों की वृद्धि पर अर्सोनिक एसिड की अद्वितीय साइटोटॉक्सिक क्षमता का पता चला, जबकि न तो ई. कोली और न ही हेला कोशिकाएं प्रभावित हुईं।पशु कोशिकाओं में कम या कोई विषाक्तता नहीं होने से अर्सोनिक एसिड डेरिवेटिव का लाभ होता है यदि उन्हें खुले कृषि क्षेत्रों में उपयोग के लिए शाकनाशी के रूप में विकसित किया जाता है।दरअसल, चूंकि सूक्ष्मनलिकाएं यूकेरियोट्स में सामान्य संरचनाएं हैं, पौधों में उनका चयनात्मक निषेध शाकनाशियों के लिए एक प्रमुख आवश्यकता है।उदाहरण के लिए, प्रोपीज़ामाइड, एक सूक्ष्मनलिका डीपोलाइमराइजिंग एजेंट जो सीधे ट्यूबुलिन से जुड़ता है और पोलीमराइजेशन को रोकता है, पशु कोशिकाओं के लिए इसकी कम विषाक्तता के कारण एक शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है।डिसोपाइरामाइड के विपरीत, संबंधित बेंज़ामाइड्स की अलग-अलग लक्ष्य विशिष्टताएँ होती हैं।पौधों के सूक्ष्मनलिकाएं के अलावा, आरएच-4032 या बेंज़ोक्सामाइड भी क्रमशः पशु कोशिकाओं या ओमीसाइकेट्स के सूक्ष्मनलिकाएं को रोकता है, और इसकी कम फाइटोटॉक्सिसिटी 25,26,27 के कारण ज़ैलिलैमाइड को कवकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है।नए खोजे गए भालू और उसके डेरिवेटिव पौधों के खिलाफ चयनात्मक साइटोटोक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य है कि आगे के संशोधनों से उनकी लक्ष्य विशिष्टता बदल सकती है, संभावित रूप से रोगजनक कवक या ओमीसाइकेट्स के नियंत्रण के लिए अतिरिक्त डेरिवेटिव प्रदान किया जा सकता है।
अर्बेनोनिक एसिड और इसके डेरिवेटिव के अद्वितीय गुण जड़ी-बूटियों के रूप में उनके विकास और अनुसंधान उपकरण के रूप में उपयोग के लिए उपयोगी हैं।पादप कोशिका आकार को नियंत्रित करने में साइटोस्केलेटन के महत्व को व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है।पहले के अध्ययनों से पता चला है कि पौधों ने मॉर्फोजेनेसिस को ठीक से नियंत्रित करने के लिए सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करके कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के जटिल तंत्र विकसित किए हैं।सूक्ष्मनलिका गतिविधि के नियमन के लिए जिम्मेदार अणुओं की एक बड़ी संख्या की पहचान की गई है, और संबंधित अनुसंधान अभी भी जारी है3,4,28।पादप कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की हमारी वर्तमान समझ कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका संगठन के तंत्र की पूरी तरह से व्याख्या नहीं करती है।उदाहरण के लिए, हालांकि डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन दोनों सूक्ष्मनलिकाएं को डीपोलाइमराइज़ कर सकते हैं, डिसोपाइरामाइड गंभीर जड़ विकृति का कारण बनता है जबकि ओरिज़ालिन का प्रभाव अपेक्षाकृत हल्का होता है।इसके अलावा, ट्यूबुलिन में उत्परिवर्तन, जो सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर करता है, जड़ों में डेक्सट्रोटेशन का कारण भी बनता है, जबकि पैक्लिटैक्सेल, जो सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता को भी स्थिर करता है, ऐसा नहीं करता है।इसलिए, उर्सोलिक एसिड के आणविक लक्ष्यों का अध्ययन और पहचान करने से पौधों के कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं के नियमन में नई अंतर्दृष्टि मिलनी चाहिए।इसी तरह, भविष्य में ऐसे रसायनों की तुलना जो विकृत वृद्धि को बढ़ावा देने में प्रभावी हैं, जैसे कि डिसोपाइरामाइड, और कम प्रभावी रसायन, जैसे कि ओरीज़लिन या कुमामोटरिक एसिड, से पता चलेगा कि विकृत वृद्धि कैसे होती है।
दूसरी ओर, रक्षा संबंधी साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था उर्सोनिक एसिड की साइटोटोक्सिसिटी को समझाने की एक और संभावना है।रोगज़नक़ का संक्रमण या पौधों की कोशिकाओं में एलीसिटर का प्रवेश कभी-कभी साइटोस्केलेटन के विनाश और बाद में कोशिका मृत्यु का कारण बनता है।उदाहरण के लिए, ओमीसीट-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सैन्थिन को तम्बाकू कोशिका मृत्यु से पहले सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित करने की सूचना मिली है, जैसा कि KAND उपचार30,31 के साथ होता है।रक्षा प्रतिक्रियाओं और अर्सोनिक एसिड से प्रेरित सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बीच समानता ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि वे सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं, हालांकि क्रिप्टोक्सैन्थिन की तुलना में अर्सोनिक एसिड का तेज़ और मजबूत प्रभाव स्पष्ट है।हालाँकि, अध्ययनों से पता चला है कि एक्टिन फिलामेंट्स का विघटन सहज कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है, जो हमेशा सूक्ष्मनलिका व्यवधान29 के साथ नहीं होता है।इसके अलावा, यह देखा जाना बाकी है कि क्या रोगज़नक़ या एलिसिटर विकृत जड़ वृद्धि का कारण बनता है, जैसा कि अर्सोनिक एसिड डेरिवेटिव करते हैं।इस प्रकार, रक्षा प्रतिक्रियाओं और साइटोस्केलेटन को जोड़ने वाला आणविक ज्ञान एक आकर्षक समस्या है जिसका समाधान किया जाना चाहिए।अर्सोनिक एसिड से संबंधित कम आणविक भार यौगिकों की उपस्थिति के साथ-साथ विभिन्न शक्तियों वाले डेरिवेटिव की एक श्रृंखला का फायदा उठाकर, वे अज्ञात सेलुलर तंत्र को लक्षित करने के अवसर प्रदान कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, नए यौगिकों की खोज और अनुप्रयोग जो सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को नियंत्रित करते हैं, पौधे कोशिका आकार निर्धारण के अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्र को संबोधित करने के लिए शक्तिशाली तरीके प्रदान करेंगे।इस संदर्भ में, हाल ही में विकसित यौगिक उर्मोटोनिक एसिड, जो सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है, सूक्ष्मनलिकाएं नियंत्रण और इन अन्य तंत्रों के बीच संबंध को समझने का अवसर प्रदान कर सकता है।इस प्रकार, अर्बेनोनिक एसिड का उपयोग करके रासायनिक और जैविक विश्लेषण से हमें आणविक नियामक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी जो पौधे के साइटोस्केलेटन को नियंत्रित करते हैं।
एस. वेरेन्सिस एमके493-सीएफ1 को 500 एमएल बफ़ल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्क में टीका लगाएं जिसमें 110 एमएल बीज माध्यम होता है जिसमें 2% (w/v) गैलेक्टोज, 2% (w/v) एसेंस पेस्ट, 1% (w/v) बैक्टो संरचना होती है। .-सोयटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.), 0.5% (w/v) मकई का अर्क (KOGOSTCH Co., Ltd., जापान), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 और विआयनीकृत पानी में 0.2% CaCO3।(नसबंदी से पहले पीएच 7.4)।बीज संस्कृतियों को 2 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी शेकर (180 आरपीएम) पर ऊष्मायन किया गया था।ठोस अवस्था किण्वन के माध्यम से उत्पादन खेती।बीज कल्चर (7 मिली) को 500 मिली के-1 फ्लास्क में स्थानांतरित किया गया जिसमें 40 ग्राम उत्पादन माध्यम था जिसमें 15 ग्राम दबाया हुआ जौ (एमयूएसओ कं, लिमिटेड, जापान) और 25 ग्राम विआयनीकृत पानी (पीएच समायोजित नहीं) था नसबंदी से पहले)।).किण्वन 14 दिनों के लिए 30°C पर अंधेरे में किया गया।किण्वन सामग्री को 40 मिलीलीटर/बोतल EtOH के साथ निकाला गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (1500 ग्राम, 4°C, 10 मिनट)।कल्चर सतह पर तैरनेवाला (60 मिली) 10% MeOH/EtOAc के मिश्रण के साथ निकाला गया था।अवशेष (59.5 मिलीग्राम) प्राप्त करने के लिए कार्बनिक परत को कम दबाव में वाष्पित किया गया था, जिसे रिवर्स चरण कॉलम (शिसीडो कैपसेल पाक सी18 यूजी120, 5 माइक्रोन, आईडी) पर ग्रेडिएंट रेफरेंस (0-10 मिनट: 90%) के साथ एचपीएलसी के अधीन किया गया था। 10 मिमी × लंबाई 250 मिमी) H2O/CH3CN, 10–35 मिनट: 90% H2O/CH3CN से 70% H2O/CH3CN (ग्रेडिएंट), 35-45 मिनट: 90% H2O/EtOH, 45-155 मिनट: 90% H2O /EtOH से 100% EtOH (ग्रेडिएंट (ग्रेडिएंट), 155-200 मिनट: 100% EtOH) 1.5 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर, कूमामोनमाइड (1, 36.0 मिलीग्राम) को एक सफेद अनाकार पाउडर के रूप में अलग किया गया था।
कुमामोटोएमाइड(1);1एच-एनएमआर (500 मेगाहर्ट्ज, सीडीसीएल3) δ 6.93 (टी, जे = 2.5 हर्ट्ज, 1एच), 6.76 (डीडी, जे = 4.3, 1.8 हर्ट्ज 1एच), 6.05 (टी, जे = 3.8 हर्ट्ज, 1एच)।), 4.08 (एस, 3एच);13सी-एनएमआर (125 मेगाहर्ट्ज, सीडीसीएल3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ईएसआई-एचआरएमएस [एम+एच]+: [सी6एच9एन2ओ2]+ परिकलित मान: 141.0659, मापा गया मान: 141.0663, आईआर νमैक्स 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 सेमी-1।
कोलंबिया के बीज (Col-0) अनुसंधान उपयोग की अनुमति के साथ अरेबिडोप्सिस जैविक संसाधन केंद्र (ABRC) से प्राप्त किए गए थे।Col-0 बीजों को हमारी प्रयोगशाला स्थितियों के तहत प्रचारित और बनाए रखा गया और जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस पौधों के रूप में उपयोग किया गया।अरेबिडोप्सिस बीजों को सतह पर निष्फल किया गया और आधी शक्ति वाले मुराशिगे और स्कूग माध्यम में 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल), 0.05% (w/v) 2-(4-मॉर्फोलिनो) एथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस) (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) युक्त बनाया गया। ).) और 1.5% अगर (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल), पीएच 5.7, 23 डिग्री सेल्सियस और निरंतर प्रकाश पर।Phs1-1 उत्परिवर्ती के बीज टी. हाशिमोटो (नारा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) द्वारा प्रदान किए गए थे।
स्ट्रेन एसआर-1 के बीज टी. हाशिमोटो (नारा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) द्वारा उपलब्ध कराए गए थे और जंगली प्रकार के तंबाकू पौधों के रूप में उपयोग किए गए थे।अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए तम्बाकू के बीजों की सतह को कीटाणुरहित किया गया और तीन रातों के लिए रोगाणुहीन पानी में भिगोया गया, फिर 2% सुक्रोज, 0.05% (w/v) एमईएस, और 0.8% गेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) युक्त आधी ताकत वाले घोल में रखा गया। मुराशिगे.और स्कूग माध्यम) पीएच 5.7 के साथ और निरंतर प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है।
स्ट्रेन टैक-1 टी. कोहची (क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान किया गया था और इसे लिवरवॉर्ट अध्ययन के लिए मानक प्रायोगिक इकाई के रूप में उपयोग किया गया था।जेम्मा निष्फल संवर्धित पौधों से प्राप्त किया गया था और फिर 1% सुक्रोज और 0.3% गेलन गम युक्त गैंबोर्ग बी 5 माध्यम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) पर चढ़ाया गया और निरंतर प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया।
तम्बाकू BY-2 सेल (निकोटियाना टैबैकम एल. सी.वी. ब्राइट येलो 2) एस. हसेज़ावा (टोक्यो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान किए गए थे।BY-2 कोशिकाओं को संशोधित लिंसमीयर और स्कूग माध्यम में 95 गुना पतला किया गया और 2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसिटिक एसिड 32 के साथ साप्ताहिक रूप से पूरक किया गया।सेल सस्पेंशन को अंधेरे में 27 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर एक रोटरी शेकर पर मिलाया गया था।कोशिकाओं को ताजे माध्यम की 10 गुना मात्रा से धोएं और उसी माध्यम में पुनः निलंबित करें।फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर के तहत सूक्ष्मनलिका मार्कर टैगआरएफपी-टीयूए 6 या एक्टिन फिलामेंट मार्कर जीएफपी-एबीडी 2 को व्यक्त करने वाली BY-2 ट्रांसजेनिक सेल लाइनें वर्णित 33,34,35 के अनुसार उत्पन्न हुईं।इन सेल लाइनों को मूल BY-2 सेल लाइन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं के समान उपयोग करके बनाए रखा और सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है।
हेला कोशिकाओं को डुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1.2 यू/एमएल पेनिसिलिन और 1.2 μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया था।
इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग जापानी जैव सुरक्षा नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
यौगिकों को स्टॉक समाधान के रूप में डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ; फ़ूजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) में भंग कर दिया गया था और एराबिडोप्सिस के लिए एमएस माध्यम और लिवरवॉर्ट के लिए तम्बाकू या गैंबोर्ग बी 5 माध्यम में पतला किया गया था।जड़ वृद्धि अवरोध परख के लिए, प्रति प्लेट 10 से अधिक बीज संकेतित यौगिकों या डीएमएसओ युक्त अगर माध्यम पर बोए गए थे।बीजों को 7 दिनों के लिए विकास कक्ष में रखा गया।पौधों की तस्वीरें खींची गईं और जड़ों की लंबाई मापी गई।अरेबिडोप्सिस अंकुरण परख के लिए, प्रति प्लेट 48 बीज 200 μM यौगिक या डीएमएसओ युक्त अगर माध्यम पर बोए गए थे।अरेबिडोप्सिस के बीज एक विकास कक्ष में उगाए गए थे और अंकुरित अंकुरों की संख्या अंकुरण (डेग) के 7 दिन बाद गिनी गई थी।तंबाकू के अंकुरण परख के लिए, प्रति प्लेट 24 बीज 200 μM KAND या DMSO युक्त अगर माध्यम पर बोए गए थे।तम्बाकू के बीज एक विकास कक्ष में उगाए गए और 14 दिनों के बाद अंकुरित पौधों की संख्या की गिनती की गई।लिवरवॉर्ट विकास अवरोध परख के लिए, प्रत्येक प्लेट से 9 भ्रूणों को KAND या DMSO की संकेतित सांद्रता वाले अगर माध्यम पर चढ़ाया गया और 14 दिनों के लिए एक विकास कक्ष में रखा गया।
जड़ मेरिस्टेम संगठन की कल्पना करने के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) से रंगे हुए पौधों का उपयोग करें।टीसीएस एसपीई कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पीआई संकेतों को देखा गया।
मलामी और बेनफे36 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार β-ग्लुकुरोनिडेज़ (जीयूएस) के साथ जड़ों का हिस्टोकेमिकल धुंधलापन किया गया था।अंकुरों को रात भर 90% एसीटोन में रखा गया, 1 घंटे के लिए जीयूएस बफर में 0.5 मिलीग्राम/एमएल 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-बीटा-डी-ग्लुकुरोनिक एसिड से रंगा गया और हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड समाधान में रखा गया।(8 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 2 मिली पानी और 1 मिली ग्लिसरॉल) और एक एक्सियो इमेजर एम1 माइक्रोस्कोप (कार्ल जीस) का उपयोग करके अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया।
लंबवत रखी प्लेटों पर उगाए गए 7 दिन पुराने पौधों पर जड़ कोणों को मापा गया।चरण 6 में बताए अनुसार गुरुत्वाकर्षण वेक्टर की दिशा से जड़ के कोण को मापें।
प्रोटोकॉल 37 में मामूली संशोधन के साथ, वर्णित के अनुसार कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिकाएं की व्यवस्था देखी गई।एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) और एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित एंटी-माउस आईजीजी (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A32723) को 1:1000 और 1:100 तनुकरण पर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में उपयोग किया गया था। क्रमश।प्रतिदीप्ति छवियां टीसीएस एसपीई कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लेइका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके हासिल की गईं।Z-स्टैक छवियां प्राप्त करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अधिकतम तीव्रता के अनुमान बनाएं।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंदो) का उपयोग करके हेला सेल प्रसार परख की गई।
ई. कोलाई DH5α की वृद्धि का विश्लेषण 600 एनएम (OD600) पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति में सेल घनत्व को मापकर किया गया था।
ट्रांसजेनिक BY-2 कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल संगठन को CSU-X1 कन्फोकल स्कैनिंग डिवाइस (योकोगावा) और एक sCMOS कैमरा (ज़ाइला, एंडोर टेक्नोलॉजी) से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया था।साइटोस्केलेटल घनत्व का मूल्यांकन छवि विश्लेषण द्वारा किया गया था, जिसमें वर्णित अनुसार ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कन्फोकल छवियों में साइटोप्लाज्मिक पिक्सल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सल का प्रतिशत निर्धारित किया गया था।
BY-2 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए, कोशिका निलंबन के एक विभाज्य को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.05% इवांस ब्लू के साथ ऊष्मायन किया गया था।मृत कोशिकाओं का चयनात्मक इवांस नीला धुंधलापन अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं से डाई को बाहर निकालने पर निर्भर करता है।दागदार कोशिकाओं को एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप (बीएक्स53, ओलंपस) का उपयोग करके देखा गया।
हेला कोशिकाओं को डीएमईएम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस के साथ विकसित किया गया था।कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए 100 μM KAND 11, कुमामोनैमिक एसिड 6, कुमामोनमाइड 1, 100 एनजी/एमएल कोल्सेमिड (गिब्को), या 100 एनजी/एमएल नोकोडमेज़ (सिग्मा) से उपचारित किया गया।कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए मेटोह के साथ और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एसीटेट के साथ तय किया गया।स्थिर कोशिकाओं को β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी (1D4A4, प्रोटीनटेक: 66240-1) के साथ 2 घंटे के लिए 0.5% बीएसए/पीबीएस में पतला किया गया, टीबीएसटी के साथ 3 बार धोया गया, और फिर एलेक्सा फ्लोर बकरी एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया।488 1 घंटा.- माउस आईजीजी (थर्मो फिशर साइंटिफिक: ए11001) और 15 एनजी/एमएल 4',6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) 0.5% बीएसए/पीबीएस में पतला।तीन बार टीबीएसटी से धोने के बाद, दागदार कोशिकाओं को निकॉन एक्लिप्स टीआई-ई इनवर्टेड माइक्रोस्कोप पर देखा गया।मेटामॉर्फ सॉफ़्टवेयर (आणविक उपकरण) का उपयोग करके ठंडे हमामात्सू ORCA-R2 सीसीडी कैमरे से छवियां कैप्चर की गईं।