पादप सूक्ष्म नलिकाओं को प्रभावित करने वाले नए पादप वृद्धि अवरोधकों के रूप में उर्सा मोनोमाइड्स की खोज, लक्षण वर्णन और कार्यात्मक सुधार।

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प्राकृतिक उत्पादों की खोज और लाभकारी उपयोग से मानव जीवन को बेहतर बनाने में मदद मिल सकती है। खरपतवारों को नियंत्रित करने के लिए पादप वृद्धि अवरोधक रसायनों का व्यापक रूप से शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है। विभिन्न प्रकार के शाकनाशी के उपयोग की आवश्यकता के कारण, क्रियाविधि के नए रूपों वाले यौगिकों की पहचान करना आवश्यक हो गया है। इस अध्ययन में, हमने स्ट्रेप्टोमाइसिस वेरेन्सिस MK493-CF1 से एक नए N-एल्कोक्सीपाइरोल यौगिक, कौमामोनमाइड की खोज की और इसकी संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित की। जैविक गतिविधि परीक्षणों के माध्यम से, हमने पाया कि उर्स-मोनोएमिक अम्ल, उर्स-मोनोमाइड का एक संश्लेषित मध्यवर्ती है और एक संभावित यौगिक है।पादप वृद्धि अवरोधकइसके अतिरिक्त, हमने विभिन्न अर्बेनोनिक अम्ल व्युत्पन्न विकसित किए हैं, जिनमें अर्बेनिलॉक्सी व्युत्पन्न (यूडीए) भी शामिल है, जो हीला कोशिकाओं की वृद्धि को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना उच्च शाकनाशी गतिविधि प्रदर्शित करता है। हमने यह भी पाया कि उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्न पादप सूक्ष्म नलिकाओं को बाधित करते हैं; इसके अतिरिक्त, केएएनडी एक्टिन तंतुओं को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है; ये बहुआयामी प्रभाव ज्ञात सूक्ष्म नलिका अवरोधकों से भिन्न हैं और अर्सोनिक अम्ल की क्रियाविधि का एक नया तंत्र सुझाते हैं, जो नए शाकनाशियों के विकास में एक महत्वपूर्ण लाभ है।
लाभकारी प्राकृतिक उत्पादों और उनके व्युत्पन्न पदार्थों की खोज और व्यावहारिक अनुप्रयोग मानव जीवन की गुणवत्ता में सुधार का एक साधन है। सूक्ष्मजीवों, पौधों और कीटों द्वारा उत्पादित द्वितीयक चयापचयों ने चिकित्सा और कृषि में महत्वपूर्ण प्रगति की है। कई एंटीबायोटिक्स और ल्यूकेमिया रोधी दवाएं प्राकृतिक उत्पादों से विकसित की गई हैं। इसके अलावा, विभिन्न प्रकार केकीटनाशककृषि में उपयोग के लिए इन प्राकृतिक उत्पादों से कवकनाशी और खरपतवारनाशक निकाले जाते हैं। विशेष रूप से, खरपतवार नियंत्रण खरपतवारनाशक आधुनिक कृषि में फसल की पैदावार बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं, और विभिन्न प्रकार के यौगिकों का व्यावसायिक रूप से पहले से ही उपयोग किया जा रहा है। पौधों में कई कोशिकीय प्रक्रियाएं, जैसे प्रकाश संश्लेषण, अमीनो अम्ल चयापचय, कोशिका भित्ति संश्लेषण, समसूत्री विभाजन का नियमन, पादप हार्मोन संकेतन या प्रोटीन संश्लेषण, खरपतवारनाशकों के विशिष्ट लक्ष्य माने जाते हैं। सूक्ष्म नलिकाओं के कार्य को बाधित करने वाले यौगिक खरपतवारनाशकों का एक सामान्य वर्ग हैं जो समसूत्री विभाजन नियमन को प्रभावित करके पौधों की वृद्धि को प्रभावित करते हैं।
माइक्रोट्यूब्यूल्स साइटोस्केलेटन के घटक हैं और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यापक रूप से संरक्षित होते हैं। ट्यूबलिन हेटेरोडाइमर में α-ट्यूबलिन और β-ट्यूबलिन होते हैं जो रैखिक माइक्रोट्यूब्यूल प्रोटोफिलामेंट्स बनाते हैं, जिनमें 13 प्रोटोफिलामेंट्स एक बेलनाकार संरचना बनाते हैं। पादप कोशिकाओं में माइक्रोट्यूब्यूल्स कई भूमिकाएँ निभाते हैं, जिनमें कोशिका का आकार निर्धारण, कोशिका विभाजन और अंतःकोशिकीय परिवहन शामिल हैं।3,4 पादप कोशिकाओं में इंटरफेज प्लाज्मा झिल्ली के नीचे माइक्रोट्यूब्यूल्स होते हैं, और ये तथाकथित कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स सेल्युलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्स के नियमन के माध्यम से सेल्युलोज माइक्रोफाइब्रिल्स के संगठन को नियंत्रित करते हैं।4,5 जड़ के सिरे के तीव्र विस्तार क्षेत्र में स्थित जड़ उपत्विका कोशिकाओं के कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स पार्श्व में स्थित होते हैं, और सेल्युलोज माइक्रोफाइबर इन माइक्रोट्यूब्यूल्स का अनुसरण करते हैं और कोशिका विस्तार की दिशा को सीमित करते हैं, जिससे विषमकोणीय कोशिका विस्तार को बढ़ावा मिलता है। इसलिए, माइक्रोट्यूब्यूल का कार्य पादप आकारिकी से निकटता से संबंधित है। ट्यूबलिन को एनकोड करने वाले जीनों में अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के कारण अरेबिडोप्सिस में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल सरणियों में विषमता और बाएँ या दाएँ ओर वृद्धि होती है 6,7। इसी प्रकार, माइक्रोट्यूब्यूल गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले माइक्रोट्यूब्यूल-संबंधित प्रोटीनों में उत्परिवर्तन भी विकृत जड़ वृद्धि का कारण बन सकते हैं 8,9,10,11,12,13। इसके अतिरिक्त, डिसोपाइरामाइड (जिसे प्रेटिलाक्लोर के नाम से भी जाना जाता है) जैसे माइक्रोट्यूब्यूल-बाधित करने वाले शाकनाशियों के साथ उपचार से भी बाईं ओर तिरछी जड़ वृद्धि होती है 14। ये आंकड़े इंगित करते हैं कि पादप वृद्धि की दिशा निर्धारित करने के लिए माइक्रोट्यूब्यूल कार्य का सटीक विनियमन महत्वपूर्ण है।
विभिन्न प्रकार के माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधकों की खोज की गई है, और इन दवाओं ने साइटोस्केलेटल अनुसंधान के साथ-साथ कृषि और चिकित्सा में भी महत्वपूर्ण योगदान दिया है।2 विशेष रूप से, ओरिज़ालिन, डाइनाइट्रोएनीलाइन यौगिक, डाइसोपाइरामाइड, बेंज़ामाइड-संबंधित यौगिक और उनके अनुरूप माइक्रोट्यूब्यूल के कार्य को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार पौधों की वृद्धि को रोक सकते हैं। इसलिए, इनका व्यापक रूप से शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, चूंकि माइक्रोट्यूब्यूल पौधों और जानवरों की कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घटक हैं, इसलिए अधिकांश माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधक दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए विषैले होते हैं। इसलिए, शाकनाशी के रूप में उनकी मान्यता प्राप्त उपयोगिता के बावजूद, व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए सीमित संख्या में एंटीमाइक्रोट्यूब्यूल एजेंटों का उपयोग किया जाता है।
स्ट्रेप्टोमाइसिस, स्ट्रेप्टोमाइसिस परिवार का एक वंश है, जिसमें वायवीय, ग्राम-पॉजिटिव, तंतुमय जीवाणु शामिल हैं और यह विभिन्न प्रकार के द्वितीयक मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करने की क्षमता के लिए व्यापक रूप से जाना जाता है। इसलिए, इसे नए जैविक रूप से सक्रिय प्राकृतिक उत्पादों के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक माना जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने कौमामोनमाइड नामक एक नए यौगिक की खोज की, जिसे स्ट्रेप्टोमाइसिस वेरेन्सिस MK493-CF1 और S. वेरेन्सिस ISP 5486 से पृथक किया गया था। स्पेक्ट्रल विश्लेषण और पूर्ण स्पेक्ट्रल विश्लेषण का उपयोग करके, कौमामोनमाइड की संरचना का लक्षण वर्णन किया गया और इसके अद्वितीय N-एल्कोक्सीपाइरोल कंकाल का निर्धारण किया गया। उर्स्मोनिक अम्ल, उर्स्मोनोमाइड और इसके व्युत्पन्नों का एक संश्लेषित मध्यवर्ती, लोकप्रिय मॉडल पौधे अरेबिडोप्सिस थालियाना की वृद्धि और अंकुरण को बाधित करता पाया गया। संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन में, हमने पाया कि C9 को उर्सोनिक अम्ल में रूपांतरित करके बनाया गया एक यौगिक, जिसे उर्सोनिक अम्ल का नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (KAND) कहा जाता है, वृद्धि और अंकुरण पर अवरोधक प्रभाव को काफी हद तक बढ़ाता है। विशेष रूप से, नव-खोजे गए इस पादप वृद्धि अवरोधक ने तंबाकू और लिवरवर्ट की वृद्धि को भी प्रभावित किया और यह जीवाणुओं या HeLa कोशिकाओं के लिए विषैला नहीं था। इसके अलावा, कुछ उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्न विकृत जड़ फेनोटाइप उत्पन्न करते हैं, जिसका अर्थ है कि ये व्युत्पन्न प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से सूक्ष्म नलिकाओं को प्रभावित करते हैं। इस विचार के अनुरूप, प्रतिरक्षा-हिस्टोकेमिकली या प्रतिदीप्त प्रोटीन से चिह्नित सूक्ष्म नलिकाओं के हमारे अवलोकन से संकेत मिलता है कि KAND उपचार सूक्ष्म नलिकाओं का अपघटन करता है। इसके अतिरिक्त, कुमामोटोनिक अम्ल व्युत्पन्नों के साथ उपचार ने एक्टिन सूक्ष्म तंतुओं को बाधित किया। इस प्रकार, हमने एक नए पादप वृद्धि अवरोधक की खोज की है जिसकी क्रियाविधि में साइटोस्केलेटन का विनाश शामिल है।
स्ट्रेन MK493-CF1 को टोक्यो के शिनागावा-कू की मिट्टी से पृथक किया गया था। स्ट्रेन MK493-CF1 ने अच्छी तरह से शाखित स्ट्रोमल माइसेलियम का निर्माण किया। 16S राइबोसोमल RNA जीन (1422 bp) के आंशिक अनुक्रम का निर्धारण किया गया। यह स्ट्रेन S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: विशिष्ट स्ट्रेन, 99.93%) के बहुत समान है। इस परिणाम के आधार पर, यह निर्धारित किया गया कि यह स्ट्रेन S. werraensis के टाइप स्ट्रेन से निकटता से संबंधित है। इसलिए, हमने इस स्ट्रेन को अस्थायी रूप से S. werraensis MK493-CF1 नाम दिया। S. werraensis ISP 5486T भी समान जैवसक्रिय यौगिकों का उत्पादन करता है। इस सूक्ष्मजीव से प्राकृतिक उत्पाद प्राप्त करने के संबंध में प्रारंभिक शोध कम होने के कारण, आगे रासायनिक शोध किया गया। एस. वेरेन्सिस एमके493-सीएफ1 को जौ माध्यम पर 30°C तापमान पर 14 दिनों तक ठोस अवस्था किण्वन द्वारा संवर्धित करने के बाद, माध्यम को 50% EtOH से निकाला गया। 60 मिलीलीटर नमूने को सुखाकर 59.5 मिलीग्राम कच्चा अर्क प्राप्त किया गया। कच्चे अर्क को रिवर्स फेज एचपीएलसी से गुजारकर एन-मेथॉक्सी-1एच-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड (1, जिसे कुमामोनामाइड नाम दिया गया, 36.0 मिलीग्राम) प्राप्त किया गया। 1 की कुल मात्रा कच्चे अर्क का लगभग 60% है। इसलिए, हमने कुमामोटोआमाइड 1 के गुणों का विस्तृत अध्ययन करने का निर्णय लिया।
कौमामोनैमाइड 1 एक सफेद अक्रिस्टलीय पाउडर है और उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 की पुष्टि करता है (चित्र 1)। इस यौगिक के C2-प्रतिस्थापित पाइरोल खंड की विशेषता δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR स्पेक्ट्रम में δH: 4.5 Hz, H-5) और δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) है, और 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन परमाणुओं की उपस्थिति दर्शाता है। C2 स्थिति पर एमाइड समूह की उपस्थिति का आकलन C-3 प्रोटॉन से एमाइड कार्बोनिल कार्बन (δC 161.1) तक HMBC सहसंबंध द्वारा किया गया। इसके अतिरिक्त, δH 4.10 (3H, S) और δC 68.3 पर 1H और 13C NMR शिखर अणु में N-मेथॉक्सी समूहों की उपस्थिति दर्शाते हैं। यद्यपि उन्नत अंतर स्पेक्ट्रोस्कोपी और न्यूक्लियर ओवरहाउसर एब्रिविएशन (NOEDF) जैसे स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषणों का उपयोग करके मेथॉक्सी समूह की सही स्थिति अभी तक निर्धारित नहीं की गई थी, फिर भी N-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सामाइड पहला संभावित यौगिक बन गया।
यौगिक 1 की सही संरचना निर्धारित करने के लिए, एक पूर्ण संश्लेषण किया गया (चित्र 2a)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2-अमीनोपाइरीडीन 2 का m-CPBA के साथ उपचार करने पर संबंधित N-ऑक्साइड 3 मात्रात्मक उपज में प्राप्त हुआ। 2 के 2-अमीनोएज़िडेशन के बाद, अब्रामोविच द्वारा वर्णित चक्रसंकुचन अभिक्रिया को बेंजीन में 90°C पर किया गया, जिससे वांछित 1-हाइड्रॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोनाइट्राइल 5 ग्राम में प्राप्त हुआ। गति 60% (दो चरण)। 15,16. इसके बाद, 4 के मिथाइलीकरण और जल अपघटन से 1-मेथॉक्सी-1H-पाइरोल-2-कार्बोक्सिलिक अम्ल (जिसे "कुमोटोनिक अम्ल", 6 कहा जाता है) अच्छी उपज (70%, दो चरण) में प्राप्त हुआ। अंत में, जलीय अमोनिया का उपयोग करके अम्ल क्लोराइड मध्यवर्ती 6 के माध्यम से एमाइडेशन करने पर कुमामोटो एमाइड 1 98% उपज में प्राप्त हुआ। संश्लेषित यौगिक 1 के सभी स्पेक्ट्रल डेटा पृथक यौगिक 1 के समान थे, इसलिए 1 की संरचना निर्धारित की गई;
अर्बेनामाइड और अर्बेनिक अम्ल की जैविक गतिविधि का सामान्य संश्लेषण और विश्लेषण। (a) कुमामोटो एमाइड का संपूर्ण संश्लेषण। (b) सात दिन पुराने जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस कोलंबिया (कोल) के पौधों को मुराशीगे और स्कूग (एमएस) प्लेटों पर उगाया गया, जिनमें निर्दिष्ट सांद्रता पर कौमामोनमाइड 6 या कौमामोनमाइड 1 मौजूद थे। स्केल बार = 1 सेमी।
सबसे पहले, हमने अर्बेनामाइड और इसके मध्यवर्ती पदार्थों की जैविक गतिविधियों का आकलन किया ताकि पौधों की वृद्धि को नियंत्रित करने की उनकी क्षमता का पता लगाया जा सके। हमने एमएस अगर माध्यम में उर्स्मोनामाइड 1 या उर्स्मोनिक अम्ल 6 की विभिन्न सांद्रताएँ मिलाईं और इस माध्यम पर अरेबिडोप्सिस थैलिआना के पौधों की वृद्धि की। इन परीक्षणों से पता चला कि उर्स्मोनामाइड 6 की उच्च सांद्रता (500 μM) ने जड़ की वृद्धि को बाधित किया (चित्र 2b)। इसके बाद, हमने उर्स्मोनिक अम्ल 6 के N1 स्थान पर प्रतिस्थापन करके विभिन्न व्युत्पन्न पदार्थ बनाए और उन पर संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन किए (समान संश्लेषण प्रक्रिया का वर्णन सहायक जानकारी (SI) में किया गया है)। अरेबिडोप्सिस के पौधों को 50 μM उर्स्मोनिक अम्ल व्युत्पन्न पदार्थों वाले माध्यम पर उगाया गया और जड़ की लंबाई मापी गई, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। चित्र 3a, b और S1 में दर्शाए अनुसार, कौमामो अम्लों में N1 स्थिति पर रैखिक एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (9, 10, 11, 12 और 13) या बड़ी एल्कोक्सी श्रृंखलाओं (15, 16 और 17) की अलग-अलग लंबाई होती है। इन व्युत्पन्नों ने जड़ वृद्धि को काफी हद तक बाधित किया। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि 200 μM 10, 11 या 17 के प्रयोग से अंकुरण बाधित हुआ (चित्र 3c और S2)।
कुमामोटो एमाइड और संबंधित यौगिकों के संरचना-गतिविधि संबंध का अध्ययन। (a) अनुरूपों की संरचना और संश्लेषण योजना। (b) 50 μM कुमामोनामाइड व्युत्पन्नों के साथ या उनके बिना एमएस माध्यम पर उगाए गए 7 दिन पुराने पौधों की जड़ की लंबाई का मात्रात्मक मापन। तारांकन चिह्न नकली उपचार के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टी परीक्षण, p < 0.05)।< 0.05). n>18. डेटा को माध्य ± मानक विचलन (SD) के रूप में दर्शाया गया है। nt का अर्थ है "परीक्षण नहीं किया गया" क्योंकि 50% से अधिक बीज अंकुरित नहीं हुए। (c) 200 μM कौमामोनमाइड और संबंधित यौगिकों के साथ या उनके बिना MS माध्यम में 7 दिनों तक इनक्यूबेट किए गए उपचारित बीजों की अंकुरण दर का मात्रात्मक विश्लेषण। तारांकन चिह्न (*) नकली उपचार (ची-स्क्वायर परीक्षण) के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। n=96।
दिलचस्प बात यह है कि C9 से लंबी एल्काइल साइड चेन के जुड़ने से अवरोधक गतिविधि कम हो गई, जिससे पता चलता है कि कुमामोटोइक एसिड से संबंधित यौगिकों को अपनी जैविक गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए एक निश्चित आकार की साइड चेन की आवश्यकता होती है।
संरचना-गतिविधि संबंध विश्लेषण से पता चला कि C9 को उर्सोनिक अम्ल में रूपांतरित किया गया था और उर्सोनिक अम्ल का नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (जिसे आगे KAND 11 कहा जाएगा) सबसे प्रभावी पादप वृद्धि अवरोधक था, इसलिए हमने KAND 11 का अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन किया। 50 μM KAND 11 के साथ अरेबिडोप्सिस के उपचार ने अंकुरण को लगभग पूरी तरह से रोक दिया, जबकि KAND 11 की कम सांद्रता (40, 30, 20, या 10 μM) ने खुराक-निर्भर तरीके से जड़ वृद्धि को बाधित किया (चित्र 4a, b)। यह परीक्षण करने के लिए कि क्या KAND 11 जड़ मेरिस्टेम की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, हमने प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) से रंगे जड़ मेरिस्टेम की जांच की और मेरिस्टेम क्षेत्र के आकार को मापा। 25 μM KAND-11 युक्त माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 151.1 ± 32.5 μm था, जबकि DMSO युक्त नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों के मेरिस्टेम का आकार 264.7 ± 30.8 μm था (चित्र 4c, d), जो दर्शाता है कि KAND-11 कोशिकीय गतिविधि को बहाल करता है। जड़ मेरिस्टेम का प्रसार। इसके अनुरूप, KAND-11 उपचार ने जड़ मेरिस्टेम में कोशिका विभाजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS सिग्नल की मात्रा को कम कर दिया (चित्र 4e) 17। ये परिणाम दर्शाते हैं कि KAND-11 कोशिका प्रसार गतिविधि को कम करके जड़ वृद्धि को रोकता है।
वृद्धि पर अर्बेनोनिक अम्ल व्युत्पन्नों (अर्बेनिलॉक्सी व्युत्पन्नों) के निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण। (a) 7 दिन पुराने जंगली प्रकार के कोल पौधों को एमएस प्लेटों पर KAND 11 की निर्दिष्ट सांद्रता के साथ उगाया गया। स्केल बार = 1 सेमी। (b) जड़ की लंबाई का परिमाणीकरण। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टुकी एचएसडी परीक्षण, p < 0.05)।< 0.05). n>16. डेटा को माध्य ± मानक विचलन (SD) के रूप में दर्शाया गया है। (c) प्रोपिडियम आयोडाइड से रंगे हुए वाइल्ड-टाइप कोल जड़ों का कन्फोकल माइक्रोस्कोपी, जिन्हें 25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाया गया था। सफेद कोष्ठक जड़ मेरिस्टेम को दर्शाते हैं। स्केल बार = 100 µm। (d) जड़ मेरिस्टेम के आकार का परिमाणीकरण (n = 10 से 11)। सांख्यिकीय अंतरों को t-परीक्षण (p < 0.05) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।< 0.05)। बार औसत मेरिस्टेम आकार को दर्शाते हैं। (ई) सीडीकेबी2 कंस्ट्रक्ट युक्त रूट मेरिस्टेम का डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी; 1प्रो: सीडीकेबी2; 1-जीयूएस से रंगे हुए और एमएस प्लेटों पर उगाए गए 5 दिन पुराने पौधों पर 25 µM केएएनडी परख के साथ या उसके बिना रंगे हुए।
KAND 11 की पादप विषाक्तता का परीक्षण एक अन्य द्विबीजपत्री पौधे, तंबाकू (निकोटियाना टैबैकम), और एक प्रमुख स्थलीय पादप मॉडल जीव, लिवरवर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमोर्फा) का उपयोग करके किया गया। अरेबिडोप्सिस की तरह, 25 μM KAND 11 युक्त माध्यम पर उगाए गए तंबाकू SR-1 के पौधों की जड़ें छोटी थीं (चित्र 5a)। इसके अतिरिक्त, 200 μM KAND 11 युक्त प्लेटों पर 48 में से 40 बीज अंकुरित हुए, जबकि सभी 48 बीज बिना उपचारित माध्यमों पर अंकुरित हुए, जिससे पता चलता है कि KAND की उच्च सांद्रता महत्वपूर्ण थी (p < 0.05)।< 0.05; ची टेस्ट -स्क्वायर) ने तंबाकू के अंकुरण को बाधित किया (चित्र 5b)। इसके अतिरिक्त, लिवरवर्ट में जीवाणु वृद्धि को बाधित करने वाली KAND 11 की सांद्रता अरेबिडोप्सिस में प्रभावी सांद्रता के समान थी (चित्र 5c)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि KAND 11 विभिन्न प्रकार के पौधों की वृद्धि को बाधित कर सकता है। फिर हमने अन्य जीवों, अर्थात् मानव HeLa कोशिकाओं और एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन DH5α में भालू मोनोएमाइड-संबंधित यौगिकों की संभावित साइटोटॉक्सिसिटी की जांच की, जो क्रमशः उच्च पशु और जीवाणु कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं। कोशिका प्रसार परीक्षणों की एक श्रृंखला में, हमने पाया कि कूमोनामाइड 1, कूमोनामाइडिक एसिड 6 और KAND 11 ने 100 μM की सांद्रता पर HeLa या E. coli कोशिकाओं की वृद्धि को प्रभावित नहीं किया (चित्र 5d,e)।
गैर-अरबीडोप्सिस जीवों में KAND 11 का वृद्धि अवरोध। (a) दो सप्ताह पुराने जंगली प्रकार के SR-1 तंबाकू के पौधों को 25 μM KAND 11 युक्त ऊर्ध्वाधर रूप से रखी MS प्लेटों पर उगाया गया। (b) दो सप्ताह पुराने जंगली प्रकार के SR-1 तंबाकू के पौधों को 200 μM KAND 11 युक्त क्षैतिज रूप से रखी MS प्लेटों पर उगाया गया। (c) दो सप्ताह पुराने जंगली प्रकार के Tak-1 लिवरवर्ट की कलियों को KAND 11 की निर्दिष्ट सांद्रता के साथ गैंबोर्ग B5 प्लेटों पर उगाया गया। लाल तीर उन बीजाणुओं को इंगित करते हैं जिनकी वृद्धि दो सप्ताह की ऊष्मायन अवधि के भीतर रुक गई। (d) HeLa कोशिकाओं का कोशिका प्रसार परीक्षण। जीवित कोशिकाओं की संख्या को निश्चित समय अंतराल पर सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके मापा गया। नियंत्रण के रूप में, HeLa कोशिकाओं को 5 μg/ml एक्टिनोमाइसिन D (Act D) से उपचारित किया गया, जो RNA पॉलीमरेज़ प्रतिलेखन को रोकता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। विश्लेषण तीन बार दोहराए गए। (ई) ई. कोलाई कोशिका प्रसार परीक्षण। ई. कोलाई की वृद्धि का विश्लेषण OD600 मापकर किया गया। नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को 50 μg/ml एम्पीसिलीन (Amp) से उपचारित किया गया, जो जीवाणु कोशिका भित्ति संश्लेषण को रोकता है। विश्लेषण तीन बार दोहराए गए।
यूरामाइड-संबंधित यौगिकों द्वारा उत्पन्न साइटोटॉक्सिसिटी की क्रियाविधि को समझने के लिए, हमने मध्यम अवरोधक प्रभाव वाले अर्बेनिक एसिड डेरिवेटिव्स का पुन: विश्लेषण किया, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। चित्र 2b और 6a में दर्शाए अनुसार, उच्च सांद्रता (200 μM) वाले उर्मोटोनिक एसिड 6 युक्त अगर प्लेटों पर उगाए गए पौधों की जड़ें छोटी और बाईं ओर मुड़ी हुई थीं (θ = – 23.7 ± 6.1), जबकि नियंत्रण माध्यम पर उगाए गए पौधों की जड़ें लगभग सीधी थीं (θ = – 3.8 ± 7.1)। यह विशिष्ट तिरछी वृद्धि कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स की शिथिलता के कारण होती है14,18। इस निष्कर्ष के अनुरूप, माइक्रोट्यूब्यूल को अस्थिर करने वाली दवाएं डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन ने हमारी वृद्धि स्थितियों के तहत जड़ों में इसी प्रकार का झुकाव उत्पन्न किया (चित्र 2b, 6a)। साथ ही, हमने उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्नों का परीक्षण किया और उनमें से कई का चयन किया जो निश्चित सांद्रता पर तिरछी जड़ वृद्धि को प्रेरित करते हैं। यौगिक 8, 9 और 15 ने क्रमशः 75 μM, 50 μM और 40 μM पर जड़ वृद्धि की दिशा को बदल दिया, जिससे पता चलता है कि ये यौगिक सूक्ष्म नलिकाओं को प्रभावी ढंग से अस्थिर कर सकते हैं (चित्र 2b, 6a)। हमने सबसे शक्तिशाली अर्सोलिक अम्ल व्युत्पन्न, KAND 11 का भी कम सांद्रता (15 µM) पर परीक्षण किया और पाया कि KAND 11 के प्रयोग से जड़ वृद्धि बाधित हुई और जड़ वृद्धि की दिशा असमान थी, हालांकि वे बाईं ओर झुकने की प्रवृत्ति रखती थीं (चित्र C3)। चूंकि सूक्ष्म नलिका-अस्थिर करने वाली दवाओं की उच्च सांद्रता कभी-कभी जड़ झुकाव पैदा करने के बजाय पौधे की वृद्धि को बाधित करती है, इसलिए हमने बाद में जड़ उपत्वचीय कोशिकाओं में कॉर्टिकल सूक्ष्म नलिकाओं का अवलोकन करके इस संभावना का आकलन किया कि KAND 11 सूक्ष्म नलिकाओं को प्रभावित करता है। 25 μM KAND 11 से उपचारित पौधों की जड़ों की उपत्वचीय कोशिकाओं में एंटी-β-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परीक्षण से पता चला कि विस्तार क्षेत्र में उपत्वचीय कोशिकाओं में लगभग सभी कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल गायब हो गए थे (चित्र 6b)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि कुमामोटोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न सीधे या अप्रत्यक्ष रूप से माइक्रोट्यूब्यूल पर क्रिया करके उन्हें बाधित करते हैं और ये यौगिक नए माइक्रोट्यूब्यूल अवरोधक हैं।
अराबिडोप्सिस थैलिआना में उर्सोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स को परिवर्तित करते हैं। (a) विभिन्न उर्मोटोनिक अम्ल व्युत्पन्नों की निर्दिष्ट सांद्रता की उपस्थिति में मापा गया जड़ झुकाव कोण। माइक्रोट्यूब्यूल्स को बाधित करने वाले दो यौगिकों: डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन के प्रभावों का भी विश्लेषण किया गया। इनसेट में जड़ वृद्धि कोण को मापने के लिए प्रयुक्त मानक दिखाया गया है। तारांकन चिह्न नकली उपचार के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टी परीक्षण, p < 0.05)।< 0.05). n>19. स्केल बार = 1 सेमी. (ख) विस्तार क्षेत्र में उपत्वचीय कोशिकाओं में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स। 25 μM KAND 11 के साथ या उसके बिना MS प्लेटों पर उगाए गए वाइल्ड-टाइप अरेबिडोप्सिस कोल जड़ों में माइक्रोट्यूब्यूल्स को β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी और एलेक्सा फ्लोरो-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग द्वारा देखा गया। स्केल बार = 10 µm. (ग) जड़ मेरिस्टेम में माइक्रोट्यूब्यूल्स की समसूत्री संरचना। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग का उपयोग करके माइक्रोट्यूब्यूल्स को देखा गया। प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ्रैग्मोप्लास्ट सहित समसूत्री संरचनाओं को कॉन्फोकल छवियों से गिना गया। तीर समसूत्री माइक्रोट्यूब्यूल संरचनाओं को इंगित करते हैं। तारांकन चिह्न शाम उपचार के साथ महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टी परीक्षण, p < 0.05)।< 0.05). n>9. स्केल बार = 50 µm.
हालांकि उर्सा में माइक्रोट्यूब्यूल फ़ंक्शन को बाधित करने की क्षमता है, लेकिन इसकी क्रियाविधि विशिष्ट माइक्रोट्यूब्यूल डीपॉलिमराइज़िंग एजेंटों से भिन्न होने की उम्मीद है। उदाहरण के लिए, डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन जैसे माइक्रोट्यूब्यूल डीपॉलिमराइज़िंग एजेंटों की उच्च सांद्रता एपिडर्मल कोशिकाओं के विषम विस्तार को प्रेरित करती है, जबकि KAND 11 ऐसा नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, KAND 11 और डिसोपाइरामाइड के सह-प्रयोग के परिणामस्वरूप डिसोपाइरामाइड-प्रेरित जड़ वृद्धि प्रतिक्रिया और KAND 11-प्रेरित वृद्धि अवरोध देखा गया (चित्र S4)। हमने KAND 11 के प्रति अतिसंवेदनशील डिसोपाइरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्ती की प्रतिक्रिया का भी विश्लेषण किया। phs1-1 में एक गैर-मानक ट्यूबलिन काइनेज बिंदु उत्परिवर्तन है और डिसोपाइरामाइड9,20 के साथ उपचारित होने पर छोटी जड़ें उत्पन्न करता है। KAND 11 युक्त अगर माध्यम पर उगाए गए phs1-1 उत्परिवर्ती पौधों की जड़ें, डिसोपाइरामिड पर उगाए गए पौधों की जड़ों के समान छोटी थीं (चित्र S5)।
इसके अतिरिक्त, हमने KAND 11 से उपचारित पौधों की जड़ मेरिस्टेम में प्रोफ़ेज़ ज़ोन, स्पिंडल और फ्रैग्मोप्लास्ट जैसी माइटोटिक माइक्रोट्यूब्यूल संरचनाएं देखीं। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS के लिए किए गए प्रेक्षणों के अनुरूप, माइटोटिक माइक्रोट्यूब्यूल की संख्या में उल्लेखनीय कमी देखी गई (चित्र 6c)।
सबसेलुलर स्तर पर KAND 11 की साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए, हमने तंबाकू BY-2 सस्पेंशन कोशिकाओं को KAND 11 से उपचारित किया और उनकी प्रतिक्रिया का अवलोकन किया। सबसे पहले, हमने KAND 11 को TagRFP-TUA6 व्यक्त करने वाली BY-2 कोशिकाओं में मिलाया, जो माइक्रोट्यूब्यूल्स को फ्लोरोसेंट रूप से लेबल करता है, ताकि कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स पर KAND 11 के प्रभाव का आकलन किया जा सके। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल घनत्व का आकलन इमेज विश्लेषण का उपयोग करके किया गया, जिसने साइटोप्लाज्मिक पिक्सेल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेल के प्रतिशत को निर्धारित किया। परीक्षण के परिणामों से पता चला कि 50 μM या 100 μM KAND 11 से 1 घंटे के उपचार के बाद, घनत्व क्रमशः 0.94 ± 0.74% या 0.23 ± 0.28% तक काफी कम हो गया, जबकि DMSO से उपचारित कोशिकाओं का घनत्व 1.61 ± 0.34% था (चित्र 7a)। ये परिणाम अरेबिडोप्सिस में देखे गए अवलोकन के अनुरूप हैं कि KAND 11 उपचार कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के डीपॉलीमराइजेशन को प्रेरित करता है (चित्र 6b)। हमने समान सांद्रता वाले KAND 11 से उपचार के बाद GFP-ABD-लेबल वाले एक्टिन फिलामेंट्स के साथ BY-2 लाइन की भी जांच की और पाया कि KAND 11 उपचार ने एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित कर दिया। 1 घंटे के लिए 50 μM या 100 μM KAND 11 से उपचार करने पर एक्टिन फिलामेंट घनत्व क्रमशः 1.20 ± 0.62% या 0.61 ± 0.26% तक काफी कम हो गया, जबकि DMSO से उपचारित कोशिकाओं में घनत्व 1.69 ± 0.51% था (चित्र 2)। 7b)। ये परिणाम प्रोपाइज़ामाइड के प्रभावों से भिन्न हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स को प्रभावित नहीं करता है, और लैट्रुनकुलिन बी, एक एक्टिन डिपॉलीमराइज़र जो माइक्रोट्यूब्यूल्स को प्रभावित नहीं करता है (एसआई चित्र एस6)। इसके अतिरिक्त, हीला कोशिकाओं में कौमामोनमाइड 1, कौमामोनमाइड एसिड 6, या केएएनडी 11 के साथ उपचार से माइक्रोट्यूब्यूल्स प्रभावित नहीं हुए (एसआई चित्र एस7)। इस प्रकार, केएएनडी 11 की क्रियाविधि ज्ञात साइटोस्केलेटन अवरोधकों से भिन्न मानी जाती है। इसके अतिरिक्त, KAND 11 से उपचारित BY-2 कोशिकाओं के हमारे सूक्ष्मदर्शी अवलोकन से पता चला कि KAND 11 उपचार के दौरान कोशिका मृत्यु शुरू हो गई थी और यह भी पता चला कि KAND 11 उपचार के 30 मिनट बाद इवांस ब्लू से रंगे मृत कोशिकाओं का अनुपात उल्लेखनीय रूप से नहीं बढ़ा, जबकि 50 μM या 100 μM KAND के साथ 90 मिनट के उपचार के बाद, मृत कोशिकाओं की संख्या क्रमशः 43.7% या 80.1% तक बढ़ गई (चित्र 7c)। कुल मिलाकर, ये आंकड़े इंगित करते हैं कि नया उर्सोलिक एसिड व्युत्पन्न KAND 11 एक पादप-विशिष्ट साइटोस्केलेटल अवरोधक है जिसकी क्रियाविधि पहले अज्ञात थी।
KAND तंबाकू BY-2 कोशिकाओं के कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स, एक्टिन फिलामेंट्स और व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। (a) TagRFP-TUA6 की उपस्थिति में BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स का दृश्य। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षण किया गया। 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल घनत्व की गणना की गई। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टुकी HSD परीक्षण, p < 0.05)।< 0.05)। स्केल बार = 10 µm। (b) GFP-ABD2 की उपस्थिति में BY-2 कोशिकाओं में कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट्स का दृश्य। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षण किया गया। 25 स्वतंत्र कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ से कॉर्टिकल एक्टिन फिलामेंट्स के घनत्व की गणना की गई। अक्षर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (टुकी HSD परीक्षण, p < 0.05)।(c) इवांस ब्लू स्टेनिंग द्वारा मृत BY-2 कोशिकाओं का अवलोकन। KAND 11 (50 μM या 100 μM) या DMSO से उपचारित BY-2 कोशिकाओं की ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई। n=3. स्केल बार = 100 µm।
नए प्राकृतिक उत्पादों की खोज और उनके उपयोग से चिकित्सा और कृषि सहित मानव जीवन के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। प्राकृतिक संसाधनों से उपयोगी यौगिक प्राप्त करने के लिए ऐतिहासिक शोध किए गए हैं। विशेष रूप से, एक्टिनोमाइसेट्स को नेमाटोड के लिए परजीवीरोधी एंटीबायोटिक के रूप में उपयोगी माना जाता है, क्योंकि इनमें विभिन्न द्वितीयक मेटाबोलाइट्स जैसे कि एवरमेक्टिन (आइवरमेक्टिन का प्रमुख यौगिक) और ब्लोमाइसिन तथा इसके व्युत्पन्न यौगिकों का उत्पादन करने की क्षमता होती है, जिनका उपयोग औषधीय रूप से कैंसररोधी एजेंट के रूप में किया जाता है।21,22 इसी प्रकार, एक्टिनोमाइसेट्स से कई प्रकार के शाकनाशी यौगिकों की खोज की गई है, जिनमें से कुछ का व्यावसायिक उपयोग पहले से ही किया जा रहा है।1,23 इसलिए, वांछित जैविक गतिविधियों वाले प्राकृतिक उत्पादों को अलग करने के लिए एक्टिनोमाइसेट मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण एक प्रभावी रणनीति माना जाता है। इस अध्ययन में, हमने एस. वेरेन्सिस से एक नए यौगिक, कौमामोनमाइड की खोज की और इसे सफलतापूर्वक संश्लेषित किया। उर्सोनिक अम्ल, अर्बेनामाइड और इसके व्युत्पन्न यौगिकों का एक संश्लेषित मध्यवर्ती है। यह जड़ों में विशिष्ट घुमाव पैदा कर सकता है, मध्यम से तीव्र शाकनाशी गतिविधि प्रदर्शित कर सकता है, और प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से पौधों की सूक्ष्म नलिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। हालांकि, उर्मोटोनिक अम्ल की क्रियाविधि मौजूदा सूक्ष्म नलिका अवरोधकों से भिन्न हो सकती है, क्योंकि KAND 11 एक्टिन तंतुओं को भी बाधित करता है और कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, जो एक नियामक तंत्र का संकेत देता है जिसके द्वारा उर्मोटोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न विभिन्न प्रकार की कोशिका कंकाल संरचनाओं को प्रभावित करते हैं।
अर्बेनोनिक अम्ल के विस्तृत अध्ययन से इसकी क्रियाविधि को बेहतर ढंग से समझने में मदद मिलेगी। विशेष रूप से, अगला लक्ष्य यह पता लगाना है कि क्या अर्बेनोनिक अम्ल, कम हुए सूक्ष्म नलिकाओं से जुड़कर उनका अपघटन करता है, या क्या उनकी क्रिया से सूक्ष्म नलिकाओं में अस्थिरता आती है। इसके अतिरिक्त, यदि सूक्ष्म नलिकाएँ प्रत्यक्ष लक्ष्य नहीं हैं, तो पादप कोशिकाओं पर अर्बेनोनिक अम्ल के क्रिया स्थल और आणविक लक्ष्यों की पहचान करने से संबंधित यौगिकों के गुणों और शाकनाशी गतिविधि को बेहतर बनाने के संभावित तरीकों को समझने में सहायता मिलेगी। हमारे जैव सक्रियता परीक्षण से पता चला कि अर्बेनोनिक अम्ल में अरेबिडोप्सिस थालियाना, तंबाकू और लिवरवर्ट जैसे पौधों की वृद्धि पर अद्वितीय विषैला प्रभाव डालने की क्षमता है, जबकि ई. कोलाई और हीला कोशिकाएँ प्रभावित नहीं हुईं। यदि अर्बेनोनिक अम्ल के व्युत्पन्नों को खुले कृषि क्षेत्रों में शाकनाशी के रूप में विकसित किया जाता है, तो पशु कोशिकाओं के लिए इनकी विषाक्तता बहुत कम या नगण्य होना एक लाभ है। दरअसल, चूंकि माइक्रोट्यूब्यूल्स यूकेरियोट्स में आम संरचनाएं हैं, इसलिए पौधों में इनका चयनात्मक अवरोध शाकनाशी के लिए एक प्रमुख आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, प्रोपाइज़ामाइड, एक माइक्रोट्यूब्यूल डीपॉलीमराइज़िंग एजेंट जो सीधे ट्यूबलिन से जुड़कर पॉलीमराइज़ेशन को रोकता है, पशु कोशिकाओं के लिए इसकी कम विषाक्तता के कारण शाकनाशी के रूप में उपयोग किया जाता है।24 डिसोपाइरामाइड के विपरीत, संबंधित बेंज़ामाइड्स की लक्ष्य विशिष्टताएँ भिन्न होती हैं। पौधों के माइक्रोट्यूब्यूल्स के अलावा, RH-4032 या बेंज़ोक्सामाइड क्रमशः पशु कोशिकाओं या ऊमाइसेट्स के माइक्रोट्यूब्यूल्स को भी अवरुद्ध करते हैं, और ज़ैलिलामाइड का उपयोग इसकी कम पादप विषाक्तता के कारण कवकनाशी के रूप में किया जाता है।25,26,27 नव-खोजे गए बियर और इसके व्युत्पन्न पौधों के प्रति चयनात्मक साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य है कि आगे के संशोधनों से इनकी लक्ष्य विशिष्टता बदल सकती है, जिससे रोगजनक कवक या ऊमाइसेट्स के नियंत्रण के लिए अतिरिक्त व्युत्पन्न प्राप्त हो सकते हैं।
अर्बेनोनिक अम्ल और इसके व्युत्पन्न पदार्थों के अद्वितीय गुण शाकनाशी के रूप में इनके विकास और अनुसंधान उपकरणों के रूप में इनके उपयोग के लिए उपयोगी हैं। पादप कोशिका के आकार को नियंत्रित करने में साइटोस्केलेटन का महत्व सर्वविदित है। पूर्व के अध्ययनों से पता चला है कि पादपों ने सूक्ष्म नलिकाओं की गति को नियंत्रित करके कॉर्टिकल सूक्ष्म नलिकाओं के संगठन की जटिल क्रियाविधियों को विकसित किया है ताकि आकारिकी को उचित रूप से नियंत्रित किया जा सके। सूक्ष्म नलिकाओं की गतिविधि के नियमन के लिए जिम्मेदार बड़ी संख्या में अणुओं की पहचान की जा चुकी है, और संबंधित अनुसंधान अभी भी जारी है3,4,28। पादप कोशिकाओं में सूक्ष्म नलिकाओं की गति की हमारी वर्तमान समझ कॉर्टिकल सूक्ष्म नलिकाओं के संगठन की क्रियाविधियों को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं करती है। उदाहरण के लिए, यद्यपि डिसोपाइरामाइड और ओरिज़ालिन दोनों सूक्ष्म नलिकाओं का अपघटन कर सकते हैं, डिसोपाइरामाइड जड़ों में गंभीर विकृति उत्पन्न करता है जबकि ओरिज़ालिन का प्रभाव अपेक्षाकृत हल्का होता है। इसके अलावा, सूक्ष्म नलिकाओं को स्थिर करने वाले ट्यूबलिन में उत्परिवर्तन जड़ों में डेक्सट्रारोटेशन का कारण भी बनते हैं, जबकि पैक्लिटैक्सेल, जो सूक्ष्म नलिकाओं की गति को भी स्थिर करता है, ऐसा नहीं करता है। इसलिए, अर्सोलिक एसिड के आणविक लक्ष्यों का अध्ययन और पहचान करने से पौधों के कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स के नियमन के बारे में नई जानकारी मिल सकती है। इसी प्रकार, विकृत वृद्धि को बढ़ावा देने वाले रसायनों, जैसे कि डिसोपाइरामाइड, और कम प्रभावी रसायनों, जैसे कि ओरिज़ालिन या कुमामोटोरिक एसिड, की भविष्य में तुलना करने से यह समझने में मदद मिलेगी कि विकृत वृद्धि कैसे होती है।
दूसरी ओर, रक्षा संबंधी साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्थाएं अर्सोनिक एसिड की साइटोटॉक्सिसिटी को समझाने की एक और संभावना है। किसी रोगजनक के संक्रमण या किसी एलिसिटर के प्रवेश से पादप कोशिकाओं में कभी-कभी साइटोस्केलेटन का विनाश और उसके बाद कोशिका मृत्यु हो जाती है29। उदाहरण के लिए, ऊमाइसेट-व्युत्पन्न क्रिप्टोजैंथिन को तंबाकू कोशिका मृत्यु से पहले माइक्रोट्यूब्यूल्स और एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित करने के लिए जाना जाता है, जो KAND उपचार के समान है30,31। रक्षा प्रतिक्रियाओं और अर्सोनिक एसिड द्वारा प्रेरित कोशिकीय प्रतिक्रियाओं के बीच समानता ने हमें यह परिकल्पना करने के लिए प्रेरित किया कि वे सामान्य कोशिकीय प्रक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं, हालांकि क्रिप्टोजैंथिन की तुलना में अर्सोनिक एसिड का प्रभाव तेज और मजबूत होता है। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि एक्टिन फिलामेंट्स का विघटन स्वतःस्फूर्त कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है, जो हमेशा माइक्रोट्यूब्यूल विघटन के साथ नहीं होता है29। इसके अलावा, यह देखना बाकी है कि क्या रोगजनक या एलिसिटर विकृत जड़ वृद्धि का कारण बनते हैं, जैसा कि अर्सोनिक एसिड व्युत्पन्न करते हैं। इसलिए, रक्षा प्रतिक्रियाओं और कोशिका कंकाल को जोड़ने वाला आणविक ज्ञान एक आकर्षक समस्या है जिस पर ध्यान देने की आवश्यकता है। उर्सोनिक अम्ल से संबंधित कम आणविक भार वाले यौगिकों के साथ-साथ विभिन्न क्षमताओं वाले कई व्युत्पन्नों की उपस्थिति का लाभ उठाकर, अज्ञात कोशिकीय तंत्रों को लक्षित करने के अवसर मिल सकते हैं।
कुल मिलाकर, माइक्रोट्यूब्यूल की गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले नए यौगिकों की खोज और अनुप्रयोग, पादप कोशिका के आकार निर्धारण के अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्रों को समझने के लिए शक्तिशाली तरीके प्रदान करेंगे। इस संदर्भ में, हाल ही में विकसित यौगिक उर्मोटोनिक अम्ल, जो माइक्रोट्यूब्यूल और एक्टिन तंतुओं को प्रभावित करता है और कोशिका मृत्यु को प्रेरित करता है, माइक्रोट्यूब्यूल नियंत्रण और इन अन्य तंत्रों के बीच संबंध को समझने का अवसर प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, अर्बेनोनिक अम्ल का उपयोग करके रासायनिक और जैविक विश्लेषण हमें पादप कोशिका कंकाल को नियंत्रित करने वाले आणविक नियामक तंत्रों को समझने में मदद करेगा।
एस. वेरेन्सिस एमके493-सीएफ1 को 500 मिलीलीटर के बैफल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्क में 110 मिलीलीटर सीड मीडियम में इनोक्यूलेट करें। इस सीड मीडियम में 2% (वजन/आयतन) गैलेक्टोज, 2% (वजन/आयतन) एसेंस पेस्ट, 1% (वजन/आयतन) बैक्टो-सोयाटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, इंक.), 0.5% (वजन/आयतन) कॉर्न एक्सट्रेक्ट (कोगोस्टच कंपनी लिमिटेड, जापान), 0.2% (वजन/आयतन) (एनएच4)2SO4 और 0.2% CaCO3 विआयनीकृत जल में मिलाया गया था (निर्जलीकरण से पहले pH 7.4)। सीड कल्चर को 27°C पर 2 दिनों के लिए रोटरी शेकर (180 आरपीएम) पर इनक्यूबेट किया गया। ठोस अवस्था किण्वन द्वारा उत्पादन संवर्धन किया गया। सीड कल्चर (7 मिली) को 500 मिली के-1 फ्लास्क में स्थानांतरित किया गया, जिसमें 40 ग्राम उत्पादन माध्यम था। इस माध्यम में 15 ग्राम दबा हुआ जौ (MUSO कंपनी लिमिटेड, जापान) और 25 ग्राम विआयनीकृत जल (निर्जलीकरण से पहले pH समायोजित नहीं किया गया) शामिल था। किण्वन प्रक्रिया 30°C तापमान पर अंधेरे में 14 दिनों तक चली। किण्वन सामग्री को 40 मिली/बोतल EtOH से निकाला गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (1500 ग्राम, 4°C, 10 मिनट)। कल्चर सुपरनेटेंट (60 मिली) को 10% MeOH/EtOAc के मिश्रण से निकाला गया। कार्बनिक परत को कम दबाव में वाष्पीकृत करके एक अवशेष (59.5 मिलीग्राम) प्राप्त किया गया, जिसे रिवर्स फेज कॉलम (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × लंबाई 250 mm) पर ग्रेडिएंट इल्यूशन (0–10 मिनट: 90%) के साथ HPLC से गुज़ारा गया। प्रवाह दर 1.5 मिली/मिनट थी, जिससे कौमामोनमाइड (1, 36.0 मिलीग्राम) को सफेद अनाकार पाउडर के रूप में पृथक किया गया।
कुमामोटोमाइड(1); 1H-NMR (500 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 मेगाहर्ट्ज, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ईएसआई-एचआरएमएस [एम+एच]+: [सी6एच9एन2ओ2]+ परिकलित मान: 141.0659, मापा गया मान: 141.0663, आईआर νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 सेमी–1.
कोलंबिया बीज (Col-0) को अनुसंधान उपयोग की अनुमति के साथ अरेबिडोप्सिस जैविक संसाधन केंद्र (ABRC) से प्राप्त किया गया था। Col-0 बीजों को हमारी प्रयोगशाला की परिस्थितियों में उगाया और संरक्षित किया गया और उन्हें जंगली प्रकार के अरेबिडोप्सिस पौधों के रूप में उपयोग किया गया। अरेबिडोप्सिस बीजों को सतही रूप से कीटाणुरहित किया गया और उन्हें 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल), 0.05% (w/v) 2-(4-मॉर्फोलिनो)एथेनसल्फोनीक अम्ल (MES) (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) और 1.5% अगर (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) युक्त अर्ध-शक्ति मुराशीगे और स्कूग माध्यम में, pH 5.7 पर, 23 डिग्री सेल्सियस तापमान और स्थिर प्रकाश में संवर्धित किया गया। phs1-1 उत्परिवर्ती के बीज टी. हाशिमोटो (नारा विज्ञान और प्रौद्योगिकी संस्थान) द्वारा प्रदान किए गए थे।
स्ट्रेन SR-1 के बीज टी. हाशिमोटो (नारा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) द्वारा उपलब्ध कराए गए थे और इन्हें जंगली प्रकार के तंबाकू पौधों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए तंबाकू के बीजों को सतही रूप से कीटाणुरहित किया गया और तीन रातों तक कीटाणुरहित पानी में भिगोया गया, फिर उन्हें 2% सुक्रोज, 0.05% (वजन/मात्रा) एमईएस और 0.8% गेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) मुराशीगे और स्कूग माध्यम वाले आधे सांद्रता वाले घोल में रखा गया, जिसका pH 5.7 था और 23°C पर निरंतर प्रकाश में इनक्यूबेट किया गया।
स्ट्रेन टाक-1 को टी. कोहची (क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा उपलब्ध कराया गया था और इसका उपयोग लिवरवर्ट अध्ययन के लिए मानक प्रायोगिक इकाई के रूप में किया गया था। जेम्मा को रोगाणुरहित संवर्धित पौधों से प्राप्त किया गया और फिर 1% सुक्रोज और 0.3% गेलन गम युक्त गैंबोर्ग बी5 माध्यम (फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) पर उगाया गया और निरंतर प्रकाश में 23°C पर इनक्यूबेट किया गया।
तंबाकू BY-2 कोशिकाएं (निकोटियाना टैबैकम एल. सीवी. ब्राइट येलो 2) एस. हसेज़ावा (टोक्यो विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गईं। BY-2 कोशिकाओं को संशोधित लिंसमेयर और स्कूग माध्यम में 95 गुना पतला किया गया और साप्ताहिक रूप से 2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसिटिक एसिड 32 के साथ पूरक किया गया। कोशिका निलंबन को 27°C पर 130 आरपीएम पर रोटरी शेकर पर अंधेरे में मिलाया गया। कोशिकाओं को ताजे माध्यम की 10 गुना मात्रा से धोएं और उसी माध्यम में पुनः निलंबित करें। फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर के तहत माइक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 या एक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 को स्थिर रूप से व्यक्त करने वाली BY-2 ट्रांसजेनिक कोशिका लाइनें वर्णित अनुसार उत्पन्न की गईं33,34,35। इन कोशिका लाइनों को मूल BY-2 कोशिका लाइन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं के समान प्रक्रियाओं का उपयोग करके बनाए रखा और सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है।
हीला कोशिकाओं को 37°C तापमान और 5% CO2 वाले इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण बोवाइन सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलिन और 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन से युक्त डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में संवर्धित किया गया।
इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग जापानी जैव सुरक्षा नियमों और दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
यौगिकों को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल) में घोलकर स्टॉक विलयन बनाया गया और फिर उन्हें अरेबिडोप्सिस और तंबाकू के लिए MS माध्यम में तथा लिवरवर्ट के लिए गैंबोर्ग B5 माध्यम में तनु किया गया। जड़ वृद्धि अवरोधन परीक्षण के लिए, संकेतित यौगिकों या DMSO युक्त अगर माध्यम पर प्रति प्लेट 10 से अधिक बीज बोए गए। बीजों को 7 दिनों के लिए वृद्धि कक्ष में रखा गया। अंकुरों की तस्वीरें ली गईं और जड़ों की लंबाई मापी गई। अरेबिडोप्सिस अंकुरण परीक्षण के लिए, 200 μM यौगिक या DMSO युक्त अगर माध्यम पर प्रति प्लेट 48 बीज बोए गए। अरेबिडोप्सिस के बीजों को वृद्धि कक्ष में उगाया गया और अंकुरण के 7 दिन बाद अंकुरित पौधों की संख्या गिनी गई। तंबाकू अंकुरण परीक्षण के लिए, 200 μM KAND या DMSO युक्त अगर माध्यम पर प्रति प्लेट 24 बीज बोए गए। तंबाकू के बीजों को वृद्धि कक्ष में उगाया गया और 14 दिनों के बाद अंकुरित पौधों की संख्या गिनी गई। लिवरवर्ट की वृद्धि अवरोधन परख के लिए, प्रत्येक प्लेट से 9 भ्रूणों को KAND या DMSO की निर्दिष्ट सांद्रता वाले अगर माध्यम पर उगाया गया और 14 दिनों के लिए एक वृद्धि कक्ष में रखा गया।
जड़ मेरिस्टेम की संरचना को देखने के लिए 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) से रंगे हुए पौधों के अंकुरों का उपयोग करें। पीआई संकेतों का अवलोकन टीसीएस एसपीई कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया।
मलामी और बेनफे36 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार, बीटा-ग्लुकुरोनिडेज़ (जीयूएस) के साथ जड़ों की हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग की गई। अंकुरों को रात भर 90% एसीटोन में स्थिर किया गया, जीयूएस बफर में 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-बी-डी-ग्लुकुरोनिक एसिड के साथ 1 घंटे के लिए रंगा गया और एक हाइड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड घोल (8 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 2 मिलीलीटर पानी और 1 मिलीलीटर ग्लिसरॉल) में रखा गया और एक्सियो इमेजर एम1 माइक्रोस्कोप (कार्ल ज़ीस) का उपयोग करके डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया।
ऊर्ध्वाधर रूप से रखी प्लेटों पर उगाए गए 7 दिन पुराने पौधों की जड़ों के कोण मापे गए। चरण 6 में वर्णित अनुसार गुरुत्वाकर्षण सदिश की दिशा से जड़ का कोण मापें।
कॉर्टिकल माइक्रोट्यूब्यूल्स की व्यवस्था का अवलोकन वर्णित प्रोटोकॉल 37 में मामूली संशोधनों के साथ किया गया। एंटी-β-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) और एलेक्सा फ्लोरो 488-संयुग्मित एंटी-माउस IgG (थर्मो फिशर साइंटिफिक: A32723) का उपयोग क्रमशः 1:1000 और 1:100 तनुकरण पर प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में किया गया। फ्लोरेसेंस छवियों को TCS SPE कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके प्राप्त किया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार Z-स्टैक छवियां प्राप्त करें और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाएं।
हेला कोशिका प्रसार परीक्षण सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था।
ई. कोलाई डीएच5α की वृद्धि का विश्लेषण 600 एनएम (ओडी600) पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके कल्चर में कोशिका घनत्व को मापकर किया गया।
ट्रांसजेनिक BY-2 कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल संगठन का अवलोकन CSU-X1 कन्फोकल स्कैनिंग डिवाइस (योकोगावा) और sCMOS कैमरा (ज़ायला, एंडोर टेक्नोलॉजी) से सुसज्जित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया। साइटोस्केलेटल घनत्व का आकलन छवि विश्लेषण द्वारा किया गया, जिसमें इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कन्फोकल छवियों में साइटोप्लाज्मिक पिक्सेल के बीच साइटोस्केलेटल पिक्सेल के प्रतिशत को निर्धारित किया गया, जैसा कि वर्णित है38,39।
BY-2 कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए, कोशिका निलंबन के एक भाग को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.05% इवांस ब्लू के साथ इनक्यूबेट किया गया। मृत कोशिकाओं का चयनात्मक इवांस ब्लू रंगाई, अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली द्वारा जीवित कोशिकाओं से डाई के निष्कासन पर निर्भर करता है।40 रंगी हुई कोशिकाओं को ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोप (BX53, ओलंपस) का उपयोग करके देखा गया।
HeLa कोशिकाओं को 37°C और 5% CO2 वाले आर्द्र इनक्यूबेटर में 10% FBS युक्त DMEM में उगाया गया। कोशिकाओं को 37°C पर 6 घंटे के लिए 100 μM KAND 11, कुमामोनैमिक एसिड 6, कुमामोनैमाइड 1, 100 ng/ml कोल्सेमिड (Gibco), या 100 ng/ml नोकोडमेज़ (Sigma) से उपचारित किया गया। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए MetOH और फिर 5 मिनट के लिए एसीटेट से स्थिर किया गया। स्थिर की गई कोशिकाओं को 0.5% BSA/PBS में तनु किए गए β-ट्यूबुलिन प्राथमिक एंटीबॉडी (1D4A4, Proteintech: 66240-1) के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, TBST से 3 बार धोया गया, और फिर एलेक्सा फ्लोरो बकरी एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। माउस आईजीजी (थर्मो फिशर साइंटिफिक: ए11001) और 15 एनजी/एमएल 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) को 0.5% बीएसए/पीबीएस में घोलकर प्रयोग किया गया। टीबीएसटी से तीन बार धोने के बाद, रंगे हुए सेलों को निकॉन एक्लिप्स टीआई-ई इनवर्टेड माइक्रोस्कोप पर देखा गया। मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर (मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) का उपयोग करके कूल्ड हमामात्सु ओआरसीए-आर2 सीसीडी कैमरे से छवियां ली गईं।