एडीज एजिप्टी (डिप्टेरा: कुलिसिडे) के विरुद्ध लार्वानाशक और वयस्क उपचार के रूप में पादप आवश्यक तेलों पर आधारित टेरपीन यौगिकों का संयोजन

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पौधों से प्राप्त कीटनाशक यौगिकों के संयोजन कीटों के विरुद्ध सहक्रियात्मक या विरोधी अंतःक्रियाएँ प्रदर्शित कर सकते हैं। एडीज़ मच्छरों द्वारा फैलाई जाने वाली बीमारियों के तेज़ी से फैलने और पारंपरिक कीटनाशकों के प्रति एडीज़ मच्छरों की आबादी में बढ़ती प्रतिरोधक क्षमता को देखते हुए, पौधों के आवश्यक तेलों पर आधारित टेरपीन यौगिकों के अट्ठाईस संयोजन तैयार किए गए और एडीज़ एजिप्टी के लार्वा और वयस्क अवस्थाओं पर उनका परीक्षण किया गया। पाँच पौधों के आवश्यक तेलों (ईओ) का आरंभ में उनके लार्वानाशक और वयस्क-उपयोग प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन किया गया, और जीसी-एमएस परिणामों के आधार पर प्रत्येक ईओ में दो प्रमुख यौगिकों की पहचान की गई। पहचाने गए मुख्य यौगिकों को खरीदा गया, अर्थात् डायलिल डाइसल्फ़ाइड, डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड, कार्वोन, लिमोनेन, यूजेनॉल, मिथाइल यूजेनॉल, यूकेलिप्टोल, यूडेसमोल और मच्छर अल्फा-पाइनिन। फिर इन यौगिकों के द्विआधारी संयोजनों को उप-घातक खुराकों का उपयोग करके तैयार किया गया और उनके सहक्रियात्मक और विरोधी प्रभावों का परीक्षण और निर्धारण किया गया। सर्वोत्तम लार्वानाशक यौगिक लिमोनीन को डायलिल डाइसल्फ़ाइड के साथ मिलाकर प्राप्त किए जाते हैं, और सर्वोत्तम वयस्कनाशक यौगिक कार्वोन को लिमोनीन के साथ मिलाकर प्राप्त किए जाते हैं। व्यावसायिक रूप से प्रयुक्त सिंथेटिक लार्वानाशक टेम्पोस और वयस्क औषधि मैलाथियान का अलग-अलग और टेरपेनॉइड्स के साथ द्विआधारी संयोजनों में परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि टेमेफोस और डायलिल डाइसल्फ़ाइड तथा मैलाथियान और यूडेसमोल का संयोजन सबसे प्रभावी संयोजन था। इन शक्तिशाली संयोजनों में एडीज़ एजिप्टी के विरुद्ध उपयोग की क्षमता है।
पादप आवश्यक तेल (ईओ) द्वितीयक उपापचयज होते हैं जिनमें विभिन्न जैवसक्रिय यौगिक होते हैं और सिंथेटिक कीटनाशकों के विकल्प के रूप में इनका महत्व लगातार बढ़ता जा रहा है। ये न केवल पर्यावरण के अनुकूल और उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं, बल्कि ये विभिन्न जैवसक्रिय यौगिकों का मिश्रण भी हैं, जिससे दवा प्रतिरोध विकसित होने की संभावना भी कम हो जाती है1। जीसी-एमएस तकनीक का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने विभिन्न पादप आवश्यक तेलों के घटकों का परीक्षण किया और 17,500 सुगंधित पौधों2 से 3,000 से अधिक यौगिकों की पहचान की, जिनमें से अधिकांश का कीटनाशक गुणों के लिए परीक्षण किया गया और बताया गया कि इनमें कीटनाशक प्रभाव हैं3,4। कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि यौगिक के मुख्य घटक की विषाक्तता इसके अपरिष्कृत एथिलीन ऑक्साइड के बराबर या उससे अधिक है। लेकिन व्यक्तिगत यौगिकों के उपयोग से प्रतिरोध विकसित होने की गुंजाइश बनी रह सकती है, जैसा कि रासायनिक कीटनाशकों5,6 के मामले में होता है। इसलिए, वर्तमान में कीटनाशक प्रभावशीलता में सुधार और लक्षित कीट आबादी में प्रतिरोध की संभावना को कम करने के लिए एथिलीन ऑक्साइड-आधारित यौगिकों के मिश्रण तैयार करने पर ध्यान केंद्रित किया जा रहा है। ईओ में मौजूद अलग-अलग सक्रिय यौगिक ईओ की समग्र गतिविधि को दर्शाते हुए संयोजनों में सहक्रियात्मक या विरोधी प्रभाव प्रदर्शित कर सकते हैं, एक तथ्य जिस पर पिछले शोधकर्ताओं द्वारा किए गए अध्ययनों में अच्छी तरह से जोर दिया गया है7,8। वेक्टर नियंत्रण कार्यक्रम में ईओ और उसके घटक भी शामिल हैं। आवश्यक तेलों की मच्छरनाशक गतिविधि का क्यूलेक्स और एनोफिलीज मच्छरों पर व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। कई अध्ययनों ने समग्र विषाक्तता को बढ़ाने और दुष्प्रभावों को कम करने के लिए विभिन्न पौधों को व्यावसायिक रूप से उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक कीटनाशकों के साथ मिलाकर प्रभावी कीटनाशक विकसित करने का प्रयास किया है9। लेकिन एडीज एजिप्टी के खिलाफ ऐसे यौगिकों के अध्ययन दुर्लभ हैं। चिकित्सा विज्ञान में प्रगति और दवाओं और टीकों के विकास ने कुछ वेक्टर जनित रोगों से निपटने में मदद की है। लेकिन एडीज एजिप्टी मच्छर द्वारा संचारित वायरस के विभिन्न सीरोटाइप की उपस्थिति ने टीकाकरण कार्यक्रमों की विफलता का कारण बना है। इसलिए, जब ऐसी बीमारियाँ होती हैं, तो रोग के प्रसार को रोकने के लिए वेक्टर नियंत्रण कार्यक्रम ही एकमात्र विकल्प हैं। वर्तमान परिदृश्य में, एडीज एजिप्टी पर नियंत्रण बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह विभिन्न वायरस और उनके सीरोटाइप का प्रमुख वेक्टर है जो डेंगू बुखार, जीका, डेंगू रक्तस्रावी बुखार, पीत ज्वर आदि का कारण बनते हैं। सबसे उल्लेखनीय बात यह है कि लगभग सभी वेक्टर-जनित एडीज जनित बीमारियों के मामलों की संख्या हर साल मिस्र में और दुनिया भर में बढ़ रही है। इसलिए, इस संदर्भ में, एडीज एजिप्टी आबादी के लिए पर्यावरण के अनुकूल और प्रभावी नियंत्रण उपायों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। इस संबंध में संभावित उम्मीदवार ईओ, उनके घटक यौगिक और उनके संयोजन हैं। इसलिए, इस अध्ययन ने एडीज एजिप्टी के खिलाफ कीटनाशक गुणों (यानी, पुदीना, पवित्र तुलसी, नीलगिरी स्पॉटेड, एलियम सल्फर और मेलालेउका) के साथ पांच पौधों से प्रमुख पौधे ईओ यौगिकों के प्रभावी सहक्रियात्मक संयोजनों की पहचान करने का प्रयास किया।
सभी चयनित ईओ ने एडीज़ एजिप्टी के विरुद्ध संभावित लार्वा-नाशक गतिविधि प्रदर्शित की, जिसका 24-घंटे LC50 मान 0.42 से 163.65 पीपीएम तक था। सबसे अधिक लार्वा-नाशक गतिविधि पुदीना (Mp) ईओ में दर्ज की गई, जिसका LC50 मान 24 घंटे पर 0.42 पीपीएम था, इसके बाद लहसुन (As) में LC50 मान 24 घंटे पर 16.19 पीपीएम दर्ज किया गया (तालिका 1)।
ओसीमम सेंटटम, ओएस ईओ को छोड़कर, अन्य सभी चार परीक्षित ईओ ने स्पष्ट एलर्जीनाशक प्रभाव दिखाए, जिनका एलसी50 मान 24 घंटे की एक्सपोज़र अवधि में 23.37 से 120.16 पीपीएम के बीच रहा। थाइमोफिलस स्ट्रिएटा (सीएल) ईओ एक्सपोज़र के 24 घंटे के भीतर 23.37 पीपीएम के एलसी50 मान वाले वयस्कों को मारने में सबसे प्रभावी रहा, इसके बाद यूकेलिप्टस मैक्यूलटा (ईएम) का स्थान रहा, जिसका एलसी50 मान 101.91 पीपीएम था (सारणी 1)। दूसरी ओर, ओएस का एलसी50 मान अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है क्योंकि उच्चतम खुराक पर 53% की उच्चतम मृत्यु दर दर्ज की गई थी (पूरक चित्र 3)।
प्रत्येक ईओ में दो प्रमुख घटक यौगिकों की पहचान और चयन एनआईएसटी लाइब्रेरी डेटाबेस परिणामों, जीसी क्रोमैटोग्राम क्षेत्र प्रतिशत और एमएस स्पेक्ट्रा परिणामों (तालिका 2) के आधार पर किया गया। ईओ एएस के लिए, पहचाने गए मुख्य यौगिक डायलिल डाइसल्फ़ाइड और डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड थे; ईओ एमपी के लिए, पहचाने गए मुख्य यौगिक कार्वोन और लिमोनेन थे, ईओ ईएम के लिए, पहचाने गए मुख्य यौगिक यूडेसमोल और यूकेलिप्टोल थे; ईओ ओएस के लिए, पहचाने गए मुख्य यौगिक यूजेनॉल और मिथाइल यूजेनॉल थे, और ईओ सीएल के लिए, पहचाने गए मुख्य यौगिक यूजेनॉल और α-पाइनीन थे (चित्र 1, अनुपूरक चित्र 5-8, अनुपूरक तालिका 1-5)।
चयनित आवश्यक तेलों (ए-डायलिल डाइसल्फ़ाइड; बी-डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड; सी-यूजेनॉल; डी-मिथाइल यूजेनॉल; ई-लिमोनीन; एफ-एरोमैटिक सेपरोन; जी-α-पिनीन; एच-सिनेओल; आर-यूडामोल) के मुख्य टेरपेनोइड्स के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के परिणाम।
कुल नौ यौगिकों (डायलिल डाइसल्फ़ाइड, डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड, यूजेनॉल, मिथाइल यूजेनॉल, कार्वोन, लिमोनेन, यूकेलिप्टोल, यूडेसमॉल, α-पिनीन) को प्रभावी यौगिकों के रूप में पहचाना गया जो ईओ के मुख्य घटक हैं और लार्वा चरणों में एडीज एजिप्टी के खिलाफ व्यक्तिगत रूप से जैवपरीक्षण किए गए थे। यूडेसमॉल यौगिक में 24 घंटे के एक्सपोजर के बाद 2.25 पीपीएम के एलसी50 मूल्य के साथ उच्चतम लार्विसाइडल गतिविधि थी। डायलिल डाइसल्फ़ाइड और डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड यौगिकों में भी संभावित लार्विसाइडल प्रभाव पाए गए हैं, जिनकी औसत उप-घातक खुराक 10-20 पीपीएम की सीमा में है। यूजेनॉल, लिमोनेन और यूकेलिप्टोल यौगिकों में फिर से मध्यम लार्विसाइडल गतिविधि देखी गई और 24 घंटे बाद क्रमशः 181.33 पीपीएम (सारणी 3)। हालाँकि, उच्चतम खुराक पर भी मिथाइल यूजेनॉल और कार्वोन की कोई महत्वपूर्ण लार्वीसाइडल क्षमता नहीं पाई गई, इसलिए LC50 मानों की गणना नहीं की गई (सारणी 3)। सिंथेटिक लार्वीसाइड टेमेफोस की एडीज़ एजिप्टी के विरुद्ध 24 घंटे के संपर्क में औसत घातक सांद्रता 0.43 पीपीएम थी (सारणी 3, अनुपूरक सारणी 6)।
सात यौगिकों (डायलिल डाइसल्फ़ाइड, डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड, यूकेलिप्टोल, α-पिनीन, यूडेसमॉल, लिमोनेन और कार्वोन) को प्रभावी ईओ के मुख्य यौगिकों के रूप में पहचाना गया और वयस्क मिस्र के एडीज मच्छरों के खिलाफ व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया गया। प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषण के अनुसार, यूडेसमॉल में 1.82 पीपीएम के एलसी50 मूल्य के साथ सबसे अधिक क्षमता पाई गई, इसके बाद 24 घंटे के एक्सपोजर समय में 17.60 पीपीएम के एलसी50 मूल्य के साथ यूकेलिप्टोल का स्थान रहा। परीक्षण किए गए शेष पांच यौगिक वयस्कों के लिए मध्यम रूप से हानिकारक थे, जिनका एलसी50 140.79 से 737.01 पीपीएम के बीच था (तालिका 3)। सिंथेटिक ऑर्गेनोफॉस्फोरस मैलाथियान यूडेसमॉल से कम शक्तिशाली था
सात शक्तिशाली सीसा यौगिकों और ऑर्गेनोफॉस्फोरस टेमेफोसेट को उनकी LC50 खुराकों के 1:1 अनुपात में द्विआधारी संयोजन तैयार करने के लिए चुना गया। कुल 28 द्विआधारी संयोजन तैयार किए गए और एडीज़ एजिप्टी के विरुद्ध उनकी लार्वा-नाशक प्रभावकारिता के लिए उनका परीक्षण किया गया। नौ संयोजन सहक्रियात्मक पाए गए, 14 संयोजन विरोधी, और पाँच संयोजन लार्वा-नाशक नहीं थे। सहक्रियात्मक संयोजनों में, डायलिल डाइसल्फ़ाइड और टेमोफ़ोल का संयोजन सबसे प्रभावी था, जिसमें 24 घंटे बाद 100% मृत्यु दर देखी गई (सारणी 4)। इसी प्रकार, डायलिल डाइसल्फ़ाइड के साथ लिमोनेन और थाइमेटफ़ॉस के साथ यूजेनॉल के मिश्रण ने 98.3% लार्वा मृत्यु दर के साथ अच्छी क्षमता दिखाई (सारणी 5)। शेष 4 संयोजनों, अर्थात् यूडेसमॉल प्लस यूकेलिप्टोल, यूडेसमॉल प्लस लिमोनेन, यूकेलिप्टोल प्लस अल्फा-पीनिन, अल्फा-पीनिन प्लस टेमेफोस ने भी महत्वपूर्ण लार्वानाशक प्रभावकारिता दिखाई, जिसमें मृत्यु दर 90% से अधिक देखी गई। अपेक्षित मृत्यु दर 60-75% के करीब है। (तालिका 4)। हालांकि, α-पीनिन या यूकेलिप्टस के साथ लिमोनेन के संयोजन ने विरोधी प्रतिक्रियाएं दिखाईं। इसी तरह, यूजेनॉल या यूकेलिप्टस या यूडेसमॉल या डायलिल ट्राइसल्फाइड के साथ टेमेफोस के मिश्रण में विरोधी प्रभाव पाए गए हैं। इसी तरह, डायलिल डाइसल्फाइड और डायलिल ट्राइसल्फाइड का संयोजन और इनमें से किसी भी यौगिक का यूडेसमॉल या यूजेनॉल के साथ संयोजन उनकी लार्वानाशक क्रिया में विरोधी हैं। यूडेसमोल के साथ यूजेनॉल या α-पाइनेन के संयोजन से भी विरोध की सूचना मिली है।
वयस्क अम्लीय क्रियाशीलता के लिए परीक्षण किए गए सभी 28 द्विआधारी मिश्रणों में से, 7 संयोजन सहक्रियात्मक थे, 6 का कोई प्रभाव नहीं पड़ा, और 15 विरोधी थे। युकेलिप्टस के साथ यूडेसमोल और कार्वोन के साथ लिमोनेन के मिश्रण अन्य सहक्रियात्मक संयोजनों की तुलना में अधिक प्रभावी पाए गए, जिनकी 24 घंटे की मृत्यु दर क्रमशः 76% और 100% थी (सारणी 5)। मैलाथियान को लिमोनेन और डायलिल ट्राइसल्फाइड को छोड़कर सभी यौगिकों के संयोजनों के साथ सहक्रियात्मक प्रभाव प्रदर्शित करते देखा गया है। दूसरी ओर, डायलिल डाइसल्फाइड और डायलिल ट्राइसल्फाइड और इनमें से किसी एक के युकेलिप्टस, या युकेलिप्टोल, या कार्वोन, या लिमोनेन के साथ संयोजन के बीच विरोध पाया गया है। इसी प्रकार, α-पाइनीन के साथ यूडेसमोल या लिमोनीन, यूकेलिप्टोल के साथ कार्वोन या लिमोनीन, और लिमोनीन के साथ यूडेसमोल या मैलाथियान के संयोजनों ने विरोधी लार्वानाशक प्रभाव दिखाए। शेष छह संयोजनों के लिए, अपेक्षित और प्रेक्षित मृत्यु दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (सारणी 5)।
सहक्रियात्मक प्रभावों और उप-घातक खुराक के आधार पर, अंततः बड़ी संख्या में एडीज एजिप्टी मच्छरों के खिलाफ उनकी लार्विसाइडल विषाक्तता का चयन किया गया और आगे परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि बाइनरी संयोजनों यूजेनॉल-लिमोनेन, डायलिल डाइसल्फ़ाइड-लिमोनेन और डायलिल डाइसल्फ़ाइड-टाइमफ़ॉस का उपयोग करते हुए देखी गई लार्वा मृत्यु दर 100% थी, जबकि अपेक्षित लार्वा मृत्यु दर क्रमशः 76.48%, 72.16% और 63.4% थी (तालिका 6)। लिमोनेन और यूडेस्मोल का संयोजन अपेक्षाकृत कम प्रभावी था, 24 घंटे के एक्सपोजर अवधि (तालिका 6) में 88% लार्वा मृत्यु दर देखी गई। सारांश में, चार चयनित बाइनरी संयोजनों ने बड़े पैमाने पर लागू होने पर एडीज एजिप्टी के खिलाफ सहक्रियात्मक लार्विसाइडल प्रभावों का भी प्रदर्शन किया (तालिका 6)।
वयस्क एडीज एजिप्टी की बड़ी आबादी को नियंत्रित करने के लिए एडल्टोसाइडल बायोएसे के लिए तीन सहक्रियात्मक संयोजनों का चयन किया गया था। बड़ी कीट कॉलोनियों पर परीक्षण करने के लिए संयोजनों का चयन करने हेतु, हमने सबसे पहले दो सर्वश्रेष्ठ सहक्रियात्मक टेरपीन संयोजनों पर ध्यान केंद्रित किया, अर्थात् कार्वोन प्लस लिमोनेन और युकलिप्टोल प्लस यूडेसमोल। दूसरे, सर्वश्रेष्ठ सहक्रियात्मक संयोजन को सिंथेटिक ऑर्गेनोफॉस्फेट मैलाथियान और टेरपेनोइड्स के संयोजन से चुना गया था। हमारा मानना ​​है कि मैलाथियान और यूडेसमोल का संयोजन बड़ी कीट कॉलोनियों पर परीक्षण के लिए सबसे अच्छा संयोजन है, क्योंकि इसमें सबसे अधिक मृत्यु दर और उम्मीदवार अवयवों का LC50 मान बहुत कम है। मैलाथियान α-पाइनीन, डायलिल डाइसल्फ़ाइड, युकलिप्टुस, कार्वोन और यूडेसमोल के साथ संयोजन में सहक्रियाशीलता प्रदर्शित करता है मैलाथियान, α-पाइनीन, डायलिल डाइसल्फ़ाइड, युकलिप्टोल और कार्वोन के गणना किए गए LC50 मान क्रमशः 5.4, 716.55, 166.02, 17.6 और 140.79 पीपीएम थे। ये मान दर्शाते हैं कि मैलाथियान और यूडेसमॉल का संयोजन खुराक के मामले में इष्टतम संयोजन है। परिणामों से पता चला है कि कार्वोन प्लस लिमोनेन और यूडेसमॉल प्लस मैलाथियान के संयोजनों में 61% से 65% की अपेक्षित मृत्यु दर की तुलना में 100% मृत्यु दर देखी गई। एक अन्य संयोजन, यूडेसमॉल प्लस युकलिप्टोल, ने 60% की अपेक्षित मृत्यु दर की तुलना में, 24 घंटे के संपर्क के बाद 78.66% की मृत्यु दर दिखाई।
इस अध्ययन में, चयनित पादप ईओ जैसे Mp, As, Os, Em और Cl ने एडीज़ एजिप्टी के लार्वा और वयस्क अवस्थाओं पर आशाजनक घातक प्रभाव दिखाए। Mp ईओ में 0.42 पीपीएम के LC50 मान के साथ सबसे अधिक लार्विनाशक गतिविधि थी, इसके बाद As, Os और Em ईओ थे जिनका 24 घंटे बाद LC50 मान 50 पीपीएम से कम था। ये परिणाम मच्छरों और अन्य द्विध्रुवीय मक्खियों पर किए गए पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं10,11,12,13,14। हालाँकि Cl की लार्विनाशक क्षमता अन्य आवश्यक तेलों की तुलना में कम है, जिसका 24 घंटे बाद LC50 मान 163.65 पीपीएम है, लेकिन इसकी वयस्क क्षमता 24 घंटे बाद 23.37 पीपीएम के LC50 मान के साथ सबसे अधिक है। एमपी, एएस और ईएम ईओ ने भी 24 घंटे के एक्सपोजर पर 100-120 पीपीएम की सीमा में एलसी50 मूल्यों के साथ अच्छी एलर्जीनाशक क्षमता दिखाई, लेकिन उनकी लार्वानाशक प्रभावकारिता की तुलना में अपेक्षाकृत कम थी। दूसरी ओर, ईओ ओएस ने उच्चतम चिकित्सीय खुराक पर भी नगण्य एलर्जीनाशक प्रभाव का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, परिणाम बताते हैं कि पौधों के लिए एथिलीन ऑक्साइड की विषाक्तता मच्छरों के विकासात्मक चरण15 के आधार पर भिन्न हो सकती है। यह कीट के शरीर में ईओ के प्रवेश की दर, विशिष्ट लक्ष्य एंजाइमों के साथ उनकी बातचीत और प्रत्येक विकासात्मक चरण16 में मच्छर की विषहरण क्षमता पर भी निर्भर करता है। बड़ी संख्या में अध्ययनों से पता चला है कि मुख्य घटक यौगिक एथिलीन ऑक्साइड की जैविक गतिविधि में एक महत्वपूर्ण कारक है जीसी-एमएस परिणामों के आधार पर, डायलिल डाइसल्फ़ाइड और डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड की पहचान ईओ ऐस के प्रमुख यौगिकों के रूप में की गई, जो पिछली रिपोर्टों19,20,21 के अनुरूप है। हालाँकि पिछली रिपोर्टों ने संकेत दिया था कि मेन्थॉल इसके मुख्य यौगिकों में से एक था, कार्वोन और लिमोनेन को फिर से एमपी ईओ22,23 के मुख्य यौगिकों के रूप में पहचाना गया। ओएस ईओ की संरचना प्रोफ़ाइल से पता चला कि यूजेनॉल और मिथाइल यूजेनॉल मुख्य यौगिक हैं, जो पहले के शोधकर्ताओं16,24 के निष्कर्षों के समान है। यूकेलिप्टोल और युकलिप्टोल को एम लीफ ऑयल में मौजूद मुख्य यौगिकों के रूप में बताया गया है, जो कुछ शोधकर्ताओं25,26 के निष्कर्षों के अनुरूप है लेकिन ओलाडे एट अल27 के निष्कर्षों के विपरीत है। विभिन्न स्थानों में एक ही पौधे की प्रजाति से निकाले गए आवश्यक तेलों की संरचना और सांद्रता में अंतर-विशिष्ट अंतर की सूचना दी गई है और इस अध्ययन में भी देखा गया है, जो भौगोलिक पौधे की वृद्धि की स्थिति, कटाई के समय, विकासात्मक चरण या पौधे की उम्र से प्रभावित होते हैं। कीमोटाइप की उपस्थिति, आदि22,30,31,32। फिर पहचाने गए प्रमुख यौगिकों को खरीदा गया और उनके लार्विसाइडल प्रभावों और वयस्क एडीज एजिप्टी मच्छरों पर प्रभावों के लिए परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि डायलिल डाइसल्फ़ाइड की लार्विसाइडल गतिविधि कच्चे ईओ एएस के बराबर थी। लेकिन डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड की गतिविधि ईओ एएस से अधिक है। ये परिणाम किम्बारिस एट अल द्वारा प्राप्त परिणामों के समान हैं। ओएस ईओ एडीज़ एजिप्टी की लार्वा अवस्था के विरुद्ध प्रभावी है, लेकिन वयस्क अवस्था के विरुद्ध नहीं। यह स्थापित किया गया है कि मुख्य यौगिकों की लार्वा-नाशक क्रिया अपरिष्कृत ओएस ईओ की तुलना में कम है। इसका तात्पर्य अपरिष्कृत एथिलीन ऑक्साइड में अन्य यौगिकों और उनकी अन्योन्यक्रियाओं की भूमिका से है। अकेले मिथाइल यूजेनॉल की क्रिया नगण्य है, जबकि अकेले यूजेनॉल की लार्वा-नाशक क्रिया मध्यम है। यह निष्कर्ष एक ओर,35,36 की पुष्टि करता है, और दूसरी ओर, पूर्ववर्ती शोधकर्ताओं के निष्कर्षों37,38 का खंडन करता है। यूजेनॉल और मिथाइल यूजेनॉल के क्रियात्मक समूहों में अंतर के कारण एक ही लक्षित कीट के लिए अलग-अलग विषाक्तताएँ हो सकती हैं39। लिमोनेन में मध्यम लार्वा-नाशक क्रिया पाई गई, जबकि कार्वोन का प्रभाव नगण्य था। इसी प्रकार, वयस्क कीटों के लिए लिमोनेन की अपेक्षाकृत कम विषाक्तता और कार्वोन की उच्च विषाक्तता कुछ पूर्व अध्ययनों के परिणामों का समर्थन करती है40, लेकिन अन्य अध्ययनों का खंडन करती है41। अंतःचक्रीय और बहिर्चक्रीय दोनों स्थितियों में दोहरे बंधों की उपस्थिति लार्विनाशकों के रूप में इन यौगिकों के लाभों को बढ़ा सकती है3,41, जबकि कार्वोन, जो असंतृप्त अल्फा और बीटा कार्बन वाला कीटोन है, वयस्कों में विषाक्तता की उच्च क्षमता प्रदर्शित कर सकता है42। हालांकि, लिमोनेन और कार्वोन की व्यक्तिगत विशेषताएं कुल ईओ एमपी (तालिका 1, तालिका 3) से बहुत कम हैं। परीक्षण किए गए टेरपेनोइड्स में, यूडेसमोल में सबसे अधिक लार्विनाशक और वयस्क गतिविधि पाई गई, जिसका LC50 मान 2.5 पीपीएम से कम था, जो इसे एडीज मच्छरों के नियंत्रण के लिए एक आशाजनक यौगिक बनाता है। इसका प्रदर्शन संपूर्ण ईओ ईएम से बेहतर है, हालांकि यह चेंग एट अल.40 के निष्कर्षों के अनुरूप नहीं है यूकेलिप्टोल में स्वयं लार्वानाशक क्रियाशीलता की तुलना में वयस्क क्रियाशीलता अधिक होती है, और पूर्व अध्ययनों के परिणाम इसका समर्थन और खंडन दोनों करते हैं37,43,44। अकेले इसकी क्रियाशीलता संपूर्ण EO Cl के लगभग बराबर है। एक अन्य द्विचक्रीय मोनोटेरपीन, α-पाइनीन, एडीज़ एजिप्टी पर लार्वानाशक क्रियाशीलता की तुलना में वयस्क क्रियाशीलता कम प्रभाव डालती है, जो पूर्ण EO Cl के प्रभाव के विपरीत है। टेरपेनॉइड्स की समग्र कीटनाशक क्रियाशीलता उनकी लिपोफिलिसिटी, अस्थिरता, कार्बन शाखाओं, प्रक्षेपण क्षेत्र, पृष्ठीय क्षेत्र, क्रियात्मक समूहों और उनकी स्थितियों45,46 से प्रभावित होती है। ये यौगिक कोशिका संचयन को नष्ट करके, श्वसन क्रियाशीलता को अवरुद्ध करके, तंत्रिका आवेगों के संचरण को बाधित करके, आदि कार्य कर सकते हैं। 47 सिंथेटिक ऑर्गेनोफॉस्फेट टेमेफोस में सबसे अधिक लार्वानाशक क्रियाशीलता पाई गई, जिसका LC50 मान 0.43 ppm है, जो लेक के आँकड़ों - उटाला48 के अनुरूप है। सिंथेटिक ऑर्गेनोफ़ॉस्फ़ोरस मैलाथियान की वयस्क सक्रियता 5.44 पीपीएम दर्ज की गई। हालाँकि इन दोनों ऑर्गेनोफ़ॉस्फ़ोरस ने एडीज़ एजिप्टी के प्रयोगशाला उपभेदों के विरुद्ध अनुकूल प्रतिक्रियाएँ दिखाई हैं, फिर भी दुनिया के विभिन्न हिस्सों में मच्छरों में इन यौगिकों के प्रति प्रतिरोध देखा गया है49। हालाँकि, हर्बल दवाओं के प्रति प्रतिरोध विकसित होने की कोई समान रिपोर्ट नहीं मिली है50। इस प्रकार, वेक्टर नियंत्रण कार्यक्रमों में वानस्पतिक पदार्थों को रासायनिक कीटनाशकों के संभावित विकल्प के रूप में माना जाता है।
लार्विसाइडल प्रभाव का परीक्षण शक्तिशाली टेरपीनॉइड्स और थाइमेटफॉस युक्त टेरपीनॉइड्स से तैयार 28 द्विआधारी संयोजनों (1:1) पर किया गया, और 9 संयोजन सहक्रियात्मक, 14 विरोधी और 5 विरोधी पाए गए। कोई प्रभाव नहीं। दूसरी ओर, वयस्क क्षमता जैव-परीक्षण में, 7 संयोजन सहक्रियात्मक, 15 संयोजन विरोधी और 6 संयोजनों का कोई प्रभाव नहीं पाया गया। कुछ संयोजनों द्वारा सहक्रियात्मक प्रभाव उत्पन्न करने का कारण संभावित यौगिकों का विभिन्न महत्वपूर्ण मार्गों में एक साथ परस्पर क्रिया करना, या किसी विशेष जैविक मार्ग के विभिन्न प्रमुख एंजाइमों का क्रमिक अवरोध हो सकता है51। डायलिल डाइसल्फ़ाइड, यूकेलिप्टस या यूजेनॉल के साथ लिमोनेन का संयोजन छोटे और बड़े दोनों पैमाने के अनुप्रयोगों में सहक्रियात्मक पाया गया (तालिका 6), जबकि यूकेलिप्टस या α-पाइनिन के साथ इसका संयोजन लार्वा पर विरोधी प्रभाव डालता पाया गया। औसतन, लिमोनेन एक अच्छा सहक्रियात्मक प्रतीत होता है, संभवतः मिथाइल समूहों की उपस्थिति, स्ट्रेटम कॉर्नियम में अच्छी पैठ और क्रिया के एक अलग तंत्र52,53 के कारण। पहले यह बताया गया है कि लिमोनेन कीट क्यूटिकल्स (संपर्क विषाक्तता) में प्रवेश करके, पाचन तंत्र को प्रभावित करके (एंटीफीडेंट), या श्वसन तंत्र (धूमन गतिविधि) को प्रभावित करके विषाक्त प्रभाव पैदा कर सकता है, 54 जबकि यूजेनॉल जैसे फेनिलप्रोपेनॉइड चयापचय एंजाइमों को प्रभावित कर सकते हैं यूकेलिप्टोल को डायलिल डाइसल्फ़ाइड, यूकेलिप्टस या α-पाइनीन के साथ सहक्रियात्मक पाया गया, लेकिन अन्य यौगिकों के साथ इसके अन्य संयोजन या तो लार्वानाशक नहीं थे या विरोधी। प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि यूकेलिप्टोल में एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (AChE) के साथ-साथ ऑक्टाएमाइन और GABA रिसेप्टर्स56 पर निरोधात्मक क्रियाविधि होती है। चूँकि चक्रीय मोनोटेरपीन्स, यूकेलिप्टोल, यूजेनॉल आदि की क्रियाविधि उनकी न्यूरोटॉक्सिक क्रियाविधि के समान हो सकती है,57 इसलिए पारस्परिक निरोध के माध्यम से उनके संयुक्त प्रभावों को न्यूनतम किया जा सकता है। इसी प्रकार, टेमेफोस का डायलिल डाइसल्फ़ाइड, α-पाइनीन और लिमोनेन के साथ संयोजन सहक्रियात्मक पाया गया, जो हर्बल उत्पादों और सिंथेटिक ऑर्गनोफॉस्फेट58 के बीच सहक्रियात्मक प्रभाव की पिछली रिपोर्टों का समर्थन करता है।
यूडेसमॉल और यूकेलिप्टोल के संयोजन का एडीज एजिप्टी के लार्वा और वयस्क चरणों पर सहक्रियात्मक प्रभाव पाया गया, संभवतः उनकी भिन्न रासायनिक संरचनाओं के कारण उनकी क्रिया के भिन्न तरीकों के कारण। यूडेसमॉल (एक सेस्क्यूटरपीन) श्वसन प्रणाली 59 को प्रभावित कर सकता है और यूकेलिप्टोल (एक मोनोटेरपीन) एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ 60 को प्रभावित कर सकता है। दो या अधिक लक्ष्य स्थलों पर अवयवों का सह-प्रदर्शन संयोजन के समग्र घातक प्रभाव को बढ़ा सकता है। वयस्क पदार्थ जैव-परीक्षणों में, मैलाथियान को कार्वोन या यूकेलिप्टोल या यूकेलिप्टोल या डायलिल डाइसल्फ़ाइड या α-पाइनिन के साथ सहक्रियात्मक पाया गया, जो दर्शाता है कि यह लिमोनेन और डाइ के योग के साथ सहक्रियात्मक है। एलिल ट्राइसल्फ़ाइड के अपवाद के साथ, टेरपीन यौगिकों के संपूर्ण पोर्टफोलियो के लिए अच्छा सहक्रियात्मक एलर्जेनसाइड उम्मीदवार। थंगम और कथिरेसन61 ने भी हर्बल अर्क के साथ मैलाथियान के सहक्रियात्मक प्रभाव के समान परिणामों की रिपोर्ट की। यह सहक्रियात्मक प्रतिक्रिया कीटों के विषहरण एंजाइमों पर मैलाथियान और फाइटोकेमिकल्स के संयुक्त विषाक्त प्रभावों के कारण हो सकती है। मैलाथियान जैसे ऑर्गनोफॉस्फेट आमतौर पर साइटोक्रोम P450 एस्टरेज़ और मोनोऑक्सीजिनेज62,63,64 को बाधित करके कार्य करते हैं। इसलिए, इन क्रियाविधि वाले मैलाथियान और विभिन्न क्रियाविधि वाले टेरपीन का संयोजन मच्छरों पर समग्र घातक प्रभाव को बढ़ा सकता है।
दूसरी ओर, विरोध यह दर्शाता है कि चयनित यौगिक अकेले प्रत्येक यौगिक की तुलना में संयोजन में कम सक्रिय होते हैं। कुछ संयोजनों में विरोध का कारण यह हो सकता है कि एक यौगिक अवशोषण, वितरण, चयापचय, या उत्सर्जन की दर को बदलकर दूसरे यौगिक के व्यवहार को संशोधित करता है। शुरुआती शोधकर्ताओं ने इसे दवा संयोजनों में विरोध का कारण माना। अणु संभावित तंत्र 65. इसी तरह, विरोध के संभावित कारण कार्रवाई के समान तंत्र, समान रिसेप्टर या लक्ष्य साइट के लिए घटक यौगिकों की प्रतिस्पर्धा से संबंधित हो सकते हैं। कुछ मामलों में, लक्ष्य प्रोटीन का गैर-प्रतिस्पर्धी निषेध भी हो सकता है। इस अध्ययन में, दो ऑर्गेनोसल्फर यौगिकों, डायलिल डाइसल्फ़ाइड और डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड यूडेसमोल और अल्फा-पिनीन चक्रीय प्रकृति के होते हैं, जबकि डायलिल डाइसल्फ़ाइड और डायलिल ट्राइसल्फ़ाइड स्निग्ध प्रकृति के होते हैं। रासायनिक संरचना के आधार पर, इन यौगिकों के संयोजन से समग्र घातक गतिविधि बढ़नी चाहिए क्योंकि उनके लक्ष्य स्थल आमतौर पर अलग-अलग होते हैं34,47, लेकिन प्रयोगात्मक रूप से हमें विरोध का पता चला, जो इन यौगिकों की इन विवो में कुछ अज्ञात जीवों की भूमिका के कारण हो सकता है। इसी तरह, सिनेओल और α-पिनीन के संयोजन ने विरोधी प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न कीं, हालाँकि शोधकर्ताओं ने पहले बताया था कि दोनों यौगिकों के क्रिया के अलग-अलग लक्ष्य हैं47,60। चूँकि दोनों यौगिक चक्रीय मोनोटेरपीन हैं, इसलिए कुछ सामान्य लक्ष्य स्थल हो सकते हैं जो बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं और अध्ययन किए गए संयोजन युग्मों की समग्र विषाक्तता को प्रभावित कर सकते हैं।
LC50 मानों और देखी गई मृत्यु दर के आधार पर, दो सर्वश्रेष्ठ सहक्रियात्मक टेरपीन संयोजनों का चयन किया गया, अर्थात् कार्वोन + लिमोनेन और यूकेलिप्टोल + यूडेसमॉल के जोड़े, साथ ही टेरपीन के साथ सिंथेटिक ऑर्गेनोफॉस्फोरस मैलाथियान। मैलाथियान + यूडेसमॉल यौगिकों के इष्टतम सहक्रियात्मक संयोजन का परीक्षण एक वयस्क कीटनाशक जैव परख में किया गया था। यह पुष्टि करने के लिए कि क्या ये प्रभावी संयोजन अपेक्षाकृत बड़े जोखिम वाले स्थानों पर बड़ी संख्या में व्यक्तियों के खिलाफ काम कर सकते हैं, बड़ी कीट कॉलोनियों को लक्षित करें। ये सभी संयोजन कीटों के बड़े झुंडों के खिलाफ एक सहक्रियात्मक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। एडीज एजिप्टी लार्वा की बड़ी आबादी के खिलाफ परीक्षण किए गए एक इष्टतम सहक्रियात्मक लार्विसाइडल संयोजन के लिए समान परिणाम प्राप्त हुए इसी तरह, सिंथेटिक लार्वीसाइड्स या एडल्टसाइड्स को टेरपीन्स के साथ मिलाकर मच्छरों को दिए जाने वाले थाइमेटफॉस या मैलाथियान की खुराक को कम करने के लिए भी प्रभावी संयोजनों का उपयोग किया जा सकता है। ये शक्तिशाली सहक्रियात्मक संयोजन एडीज़ मच्छरों में दवा प्रतिरोध के विकास पर भविष्य के अध्ययनों के लिए समाधान प्रदान कर सकते हैं।
एडीज़ एजिप्टी के अंडे भारतीय आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद के क्षेत्रीय आयुर्विज्ञान अनुसंधान केंद्र, डिब्रूगढ़ से एकत्रित किए गए और गुवाहाटी विश्वविद्यालय के प्राणी विज्ञान विभाग में नियंत्रित तापमान (28 ± 1 °C) और आर्द्रता (85 ± 5%) पर निम्नलिखित परिस्थितियों में रखे गए: अरिवोली का वर्णन किया गया। अंडे सेने के बाद, लार्वा को लार्वा आहार (कुत्ते के बिस्कुट का पाउडर और यीस्ट 3:1 के अनुपात में) और वयस्कों को 10% ग्लूकोज घोल दिया गया। निकलने के तीसरे दिन से, वयस्क मादा मच्छरों को एल्बिनो चूहों का खून चूसने दिया गया। एक गिलास में पानी में फिल्टर पेपर भिगोएँ और उसे अंडे देने वाले पिंजरे में रखें।
चयनित पौधों के नमूने: यूकेलिप्टस के पत्ते (मायर्टेसी), तुलसी (लैमियासी), पुदीना (लैमियासी), मेलाल्यूका (मायर्टेसी) और एलियम बल्ब (एमरीलीडेसी)। गुवाहाटी से एकत्रित और गुवाहाटी विश्वविद्यालय के वनस्पति विज्ञान विभाग द्वारा पहचाने गए। एकत्रित पौधों के नमूनों (500 ग्राम) को क्लेवेंजर उपकरण का उपयोग करके 6 घंटे तक हाइड्रोडिस्टिलेशन प्रक्रिया से गुजारा गया। निकाले गए ईओ को साफ काँच की शीशियों में एकत्र किया गया और आगे के अध्ययन के लिए 4°C पर संग्रहित किया गया।
लार्विसाइडल विषाक्तता का अध्ययन थोड़े संशोधित मानक विश्व स्वास्थ्य संगठन प्रक्रियाओं 67 का उपयोग करके किया गया था। एक पायसीकारक के रूप में DMSO का उपयोग करें। प्रत्येक EO सांद्रता का परीक्षण शुरू में 100 और 1000 पीपीएम पर किया गया था, प्रत्येक प्रतिकृति में 20 लार्वा को उजागर किया गया था। परिणामों के आधार पर, एक सांद्रता सीमा लागू की गई और मृत्यु दर 1 घंटे से 6 घंटे (1 घंटे के अंतराल पर) और उपचार के 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे बाद दर्ज की गई। 24, 48 और 72 घंटे के एक्सपोजर के बाद उप-घातक सांद्रता (LC50) निर्धारित की गई। प्रत्येक सांद्रता को एक नकारात्मक नियंत्रण (केवल पानी) और एक सकारात्मक नियंत्रण (DMSO-उपचारित पानी) के साथ तीन प्रतियों में परखा गया था।
रामर एट अल. 69 द्वारा वर्णित विधि का उपयोग एसीटोन को विलायक के रूप में उपयोग करते हुए एडीज एजिप्टी के खिलाफ एक वयस्क जैव परख के लिए किया गया था। प्रत्येक ईओ को शुरू में 100 और 1000 पीपीएम की सांद्रता पर वयस्क एडीज एजिप्टी मच्छरों के खिलाफ परीक्षण किया गया था। प्रत्येक तैयार घोल के 2 मिलीलीटर को व्हाटमैन नंबर पर लगाएं। फिल्टर पेपर का 1 टुकड़ा (आकार 12 x 15 सेमी2) और एसीटोन को 10 मिनट तक वाष्पित होने दें। केवल 2 मिलीलीटर एसीटोन से उपचारित फिल्टर पेपर को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एसीटोन के वाष्पित हो जाने के बाद, उपचारित फिल्टर पेपर और नियंत्रण फिल्टर पेपर को एक बेलनाकार ट्यूब (10 सेमी गहरी) में रखा जाता है मच्छर छोड़ने के 1 घंटे, 2 घंटे, 3 घंटे, 4 घंटे, 5 घंटे, 6 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे बाद मृत्यु दर दर्ज की गई। 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे के एक्सपोज़र समय के लिए LC50 मानों की गणना करें। यदि नियंत्रण समूह की मृत्यु दर 20% से अधिक है, तो पूरा परीक्षण दोहराएँ। इसी प्रकार, यदि नियंत्रण समूह में मृत्यु दर 5% से अधिक है, तो एबॉट के सूत्र68 का उपयोग करके उपचारित नमूनों के परिणामों को समायोजित करें।
चयनित आवश्यक तेलों के घटक यौगिकों का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी (एजिलेंट 7890A) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (Accu TOF GCv, Jeol) का प्रयोग किया गया। GC एक FID डिटेक्टर और एक केशिका स्तंभ (HP5-MS) से सुसज्जित था। वाहक गैस हीलियम थी, प्रवाह दर 1 मिली/मिनट थी। जीसी कार्यक्रम एलियम सैटिवम को 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M और ओसीमम सेंटम को 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 - 280 पर सेट करता है, पुदीना के लिए 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, नीलगिरी के लिए 20.60-1M-10-200-3M-30-280, और लाल के लिए एक हजार परतों के लिए वे उन्हें 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M हैं।
प्रत्येक ईओ के प्रमुख यौगिकों की पहचान जीसी क्रोमैटोग्राम और मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों (एनआईएसटी 70 मानक डेटाबेस से संदर्भित) से गणना किए गए क्षेत्र प्रतिशत के आधार पर की गई थी।
प्रत्येक ईओ में दो प्रमुख यौगिकों का चयन जीसी-एमएस परिणामों के आधार पर किया गया और आगे के जैव-परीक्षणों के लिए सिग्मा-एल्ड्रिच से 98-99% शुद्धता पर खरीदा गया। यौगिकों का एडीज़ एजिप्टी के विरुद्ध लार्वानाशक और वयस्क प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया गया, जैसा कि ऊपर वर्णित है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले सिंथेटिक लार्वानाशक टेमेफोसेट (सिग्मा एल्ड्रिच) और वयस्क दवा मैलाथियान (सिग्मा एल्ड्रिच) का विश्लेषण उसी प्रक्रिया का पालन करते हुए, चयनित ईओ यौगिकों के साथ उनकी प्रभावशीलता की तुलना करने के लिए किया गया।
चयनित टेरपीन यौगिकों और टेरपीन यौगिकों तथा व्यावसायिक ऑर्गेनोफॉस्फेट (टाइलफॉस और मैलाथियान) के द्विआधारी मिश्रण, प्रत्येक संभावित यौगिक की LC50 खुराक को 1:1 के अनुपात में मिलाकर तैयार किए गए। तैयार संयोजनों का परीक्षण एडीज़ एजिप्टी के लार्वा और वयस्क अवस्थाओं पर ऊपर वर्णित अनुसार किया गया। प्रत्येक जैव-परीक्षण प्रत्येक संयोजन के लिए तीन प्रतियों में और प्रत्येक संयोजन में उपस्थित व्यक्तिगत यौगिकों के लिए तीन प्रतियों में किया गया। लक्षित कीटों की मृत्यु 24 घंटे बाद दर्ज की गई। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके द्विआधारी मिश्रण के लिए अपेक्षित मृत्यु दर की गणना करें।
जहां E = द्विआधारी संयोजन, यानी कनेक्शन (A + B) के जवाब में एडीज एजिप्टी मच्छरों की अपेक्षित मृत्यु दर।
प्रत्येक द्विआधारी मिश्रण के प्रभाव को पावला52 द्वारा वर्णित विधि द्वारा परिकलित χ2 मान के आधार पर सहक्रियात्मक, विरोधी, या कोई प्रभाव नहीं के रूप में चिह्नित किया गया था। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक संयोजन के लिए χ2 मान की गणना करें।
किसी संयोजन के प्रभाव को सहक्रियात्मक तब माना जाता था जब परिकलित χ2 मान संगत स्वतंत्रता अंशों (95% विश्वास अंतराल) के लिए तालिका मान से अधिक होता था और यदि प्रेक्षित मृत्यु दर अपेक्षित मृत्यु दर से अधिक पाई जाती थी। इसी प्रकार, यदि किसी संयोजन के लिए परिकलित χ2 मान कुछ स्वतंत्रता अंशों के साथ तालिका मान से अधिक होता है, लेकिन प्रेक्षित मृत्यु दर अपेक्षित मृत्यु दर से कम होती है, तो उपचार को प्रतिकूल माना जाता है। और यदि किसी संयोजन में परिकलित χ2 मान संगत स्वतंत्रता अंशों में तालिका मान से कम होता है, तो संयोजन का कोई प्रभाव नहीं माना जाता है।
बड़ी संख्या में कीड़ों के खिलाफ परीक्षण के लिए तीन से चार संभावित सहक्रियात्मक संयोजनों (100 लार्वा और 50 लार्विसाइडल और वयस्क कीट गतिविधि) का चयन किया गया था। वयस्क) ऊपर बताए अनुसार आगे बढ़ते हैं। मिश्रणों के साथ, चयनित मिश्रणों में मौजूद व्यक्तिगत यौगिकों का भी बराबर संख्या में एडीज एजिप्टी लार्वा और वयस्कों पर परीक्षण किया गया था। संयोजन अनुपात एक उम्मीदवार यौगिक का एक हिस्सा LC50 खुराक और अन्य घटक यौगिक का एक हिस्सा LC50 खुराक है। वयस्क गतिविधि बायोएसे में, चयनित यौगिकों को विलायक एसीटोन में भंग कर दिया गया और 1300 सेमी 3 बेलनाकार प्लास्टिक कंटेनर में लिपटे फिल्टर पेपर पर लागू किया गया। एसीटोन को 10 मिनट के लिए वाष्पित किया गया और वयस्कों को छोड़ दिया गया। इसी तरह, लार्विसाइडल बायोएसे में, LC50 उम्मीदवार यौगिकों की खुराक पहले डीएमएसओ के बराबर मात्रा में भंग कर दी गई
LC50 मानों की गणना करने के लिए SPSS (संस्करण 16) और मिनिटैब सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 71 दर्ज मृत्यु दर डेटा का संभाव्य विश्लेषण किया गया।